NGR短肽的188Re标记及其在荷瘤裸鼠体内的生物分布和SPECT显像

锁耀宇,杨卫东,马晓伟,汪 静

(第四军医大学 西京医院核医学科,陕西 西安 710032)

以肿瘤血管作为靶点对肿瘤进行靶向性研究是肿瘤诊断和治疗的一个重要策略。含有特异序列的多肽RGD和NGR等是针对肿瘤血管的特异性配体,目前已成为肿瘤靶向性研究的热点。

肿瘤血管生成是肿瘤生长的关键环节[1-2],肿瘤新生血管的形成受CD13、αvβ3整合素(Integrin)等多种蛋白分子的调控。αvβ3整合素在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞内高表达[3-4],含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的多肽能与αvβ3高度特异性结合。放射性核素标记RGD多肽用于肿瘤显像和治疗的研究已有多篇报道[5-7]。CD13(氨肽酶N)是一种跨膜蛋白酶。研究表明,与αvβ3整合素一样,CD13表达于肿瘤新生血管内皮细胞,在正常组织血管内皮细胞中低表达或不表达[8]。因此CD13可以作为肿瘤靶向性研究的一个理想靶位。NGR是应用噬菌体随机多肽库技术筛选的一个核心序列为天冬酰胺(Asparagine,N)、甘氨酸(Glycine,G)、精氨酸(Arginine,R)的多肽,能与肿瘤新生血管内皮细胞的CD13特异结合[9]。因此,国内外已有学者将NGR作为载体与肿瘤坏死因子(TNF)、脂质体、血管形成抑制因子以及干扰素等多种药物耦联进行肿瘤显像、治疗以及疗效评价的研究[10-13]。研究[14-15]表明,以肿瘤新生血管内皮细胞CD13为靶点,能够明显提高药物的靶向性和抗肿瘤效果。188Re半衰期短,可发射穿透距离短、具有适宜治疗的β射线和适于显像的γ射线,且制备简易可行,可作为肿瘤放免导向治疗核素[16-17]。本工作拟制备15肽的188Re-NGR,并研究其在荷HepG2肝癌细胞的严重联合免疫缺陷(SCID)裸鼠模型体内的生物分布和SPECT显像。

1 主要实验材料

1.1 试剂和仪器

NGR:纯度＞98%,西安第四军医大学生物技术中心制备;二巯基乙醇:美国Sigma公司产品;SnCl2·2H2O、葡萄糖酸钠:北京化学试剂公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

188W-188Re发生器:原子高科股份有限公司产品;GF254层析硅胶板、Sep-Pak C18反相萃取柱:美国Waters公司产品;Mini-Scan型放射性薄层扫描仪:美国Bioscan公司产品;单道γ计数仪:西安志达科技有限公司产品;SPECT/CT:德国西门子公司产品。

HePG2肝癌细胞株:上海复旦大学中山医院肿瘤研究所提供。

1.2 实验动物

严重联合免疫缺陷(SCID)裸鼠:约30 g,30只,清洁级,4～6周龄,中国科学院上海实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 188Re-NGR的制备

[18]的方法,并略加改动制备得到188Re-NGR。NGR的化学结构示于图 1,188Re-NGR制备流程示于图2。具体方法为:在40μg NGR中加入二巯基乙醇(二巯基乙醇与NGR摩尔浓度比约为1 000∶1),混匀后室温放置 30 min,加入200μL 0.2 mol/L p H 6.0的醋酸钠缓冲液,5 mg葡萄糖酸钠溶液,30μL氯化亚锡溶液(3.0 g/L,0.1 mol/L HCl溶解)和37 MBq Na188ReO4溶液,混匀,室温下放置2 h,完成标记。

2.2 188Re-NGR的标记率及放化纯度的测定

用薄层层析法(TLC)测定188Re-NGR标记率。采用GF254层析硅胶板作为固定相,分别以丙酮、生理盐水、V(乙醇)∶V(水)∶V(氨水)=2∶5∶1为流动相展开。根据不同展开体系中所得到各标记物放射性计数,分别以下式计算标记率及标记物比活度:标记率=[(188Re-NGR+188Re-胶体+188Re-配体)放射性计数/总放射性计数]×100%-(188Re-胶体+188Re-配体)放射性计数/总放射性计数×100%;比活度(PBq/g)=188ReO4-放射性活度(TBq)×标记率÷NGR质量(mg)。

标记物经Sep-Pak C18柱进行纯化后,TLC法测定放化纯度。Sep-Pak C18柱纯化:用10 mL蒸馏水饱和Sep-Pak C18柱,并用10 mL无水乙醇淋洗Sep-Pak C18柱进行活化。将准备好的188Re-NGR溶液加入Sep-Pak C18柱中,以10 mL的蒸馏水将未反应完的188ReO4-洗去,用氮气吹干硅胶柱后,以1 mL的80%乙醇淋洗Sep-Pak,此部分为188Re-NGR。TLC法测定放化纯度的条件与测标记率的相同。

图1 NGR的化学结构示意图

图2 188 Re-NGR制备流程示意图

2.3 188Re-NGR稳定性测定

取200μL188Re-NGR,用 500μL的小牛血清稀释,于 37 ℃下保存 ,分别于 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h取少量样品测放化纯度。

2.4 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠体内生物分布

将30只肿瘤直径约 0.8～1.0 cm的荷Hep G2瘤裸鼠模型随机分成 6组,每组 5只,经尾静脉注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,于注射后1、2、4、8、12、24 h 按组将小鼠处死。另取5只荷HePG2瘤裸鼠作为竞争性抑制组,于注射188Re-NGR前1 h先注射未标记的NGR(NGR与188Re-NGR摩尔比为10∶1),并于注射188Re-NGR后12 h处死。取血及主要脏器,称取脏器质量并测量放射性计数,经衰减校正后计算每克组织的放射性摄取率(%ID/g)。并计算靶组织(T)与非靶组织(NT)的放射性摄取比(T/NT)。

2.5 SPECT显像

取3只荷 HePG2瘤裸鼠,经尾静脉注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,另取3只作为竞争性抑制组,注射188Re-NGR前1 h先注射未标记的NGR(NGR与188Re-NGR摩尔比为10∶1),并于注射后 1、2、4、8 、12、24 h 进行静态显像,使用针孔准直器,矩阵 128×128,Zoom 1.33,每帧采集30 min。

3 结果与讨论

3.1 188Re-NGR的制备

该直接标记法中以SnCl2快速还原188ReO4-,并采用葡萄糖酸钠作为中间配体,与188Re保持弱络合作用,将188Re保持在稳定的低价态,保证了188Re与还原后的NGR配位交换反应的顺利进行。经TLC法测定,标记物中各成分的Rf列于表1。根据表1中各物质的Rf计算可知,188Re-NGR的标记率＞85%。

表1 标记液中各成分在不同展开体系中的R f

经Sep-Pak C18反向萃取柱纯化,188Re-NGR的放化纯度＞90%。188Re-NGR比活度为(0.79±0.02)TBq/g。188Re-NGR 在 37 ℃小牛血清中放置 0 、0.5 、1、2、4、8、12、24 h 后 ,放化纯度分别为 93.0%、91.8%、89.4%、88.9%、85.3%、82.0%、80.6%、65.7%,因此188Re-NGR可在体外稳定存放2 h。

3.2 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠体内生物分布

188Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠体内的生物分布列于表 2,由表2可知,188Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠血液中清除较快,注射后1 h放射性摄取为(2.53±0.21)%ID/g,注射后24 h为(0.19±0.02)%ID/g;注射后1～12 h肾脏摄取始终保持在约10%ID/g,标记物在肝脏和肠道中亦有较高摄取,提示188Re-NGR主要经肾脏排泄,其次为消化道;肿瘤组织 12 h摄取为(4.62±0.71)%ID/g,24 h时摄取仍有(2.01±0.38)%ID/g,表明188Re-NGR在肿瘤组织内停留时间较长;骨骼肌等非靶组织摄取少且清除快。在竞争性抑制组中,12 h时肿瘤组织放射性摄取为(1.43±0.61)%ID/g,明显低于实验组。

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠体内生物分布(,n=5)

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠体内生物分布(,n=5)

组织或器官放射性摄取/(%ID·g-1)1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制组(12 h)血液 2.53±0.21 1.52±0.19 1.05±0.24 0.96±0.15 0.68±0.05 0.19±0.02 1.22±0.37心脏 1.73±0.13 2.68±0.51 1.62±0.14 1.53±0.18 1.21±0.26 0.52±0.14 1.37±0.40肺 1.21±0.31 1.39±0.23 1.14±0.27 1.07±0.09 0.83±0.20 0.28±0.06 0.97±0.52肝 7.15±0.53 9.12±0.81 8.21±0.33 6.51±0.60 6.28±0.45 4.75±0.42 5.16±1.04脾 1.82±0.22 2.11±0.30 1.57±0.15 1.12±0.31 0.94±0.11 0.51±0.23 1.20±0.29肾 9.51±0.62 10.84±0.42 14.05±0.68 14.73±0.84 11.92±0.39 4.03±0.34 15.82±0.70胃 1.02±0.24 1.62±0.16 1.04±0.41 0.84±0.12 0.53±0.08 0.31±0.07 0.91±0.53肠道 3.11±0.61 7.51±0.67 6.85±0.73 5.01±0.41 4.16±0.56 2.06±0.29 4.55±0.47肌肉 1.25±0.20 1.24±0.25 1.16±0.13 1.10±0.21 0.97±0.34 0.94±0.15 1.33±0.27肿瘤 2.84±0.51 3.12±0.72 3.55±0.21 3.98±0.37 4.62±0.71 2.01±0.38 1.43±0.61

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

组织或器官T/NT 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制组(12 h)肿瘤与肌肉 2.27±0.31 2.52±0.20 3.06±0.49 3.62±0.55 4.76±0.36 2.14±0.11 1.08±0.24心脏与肌肉 1.38±0.21 2.16±0.35 1.40±0.16 1.39±0.41 1.25±0.22 0.56±0.19 1.03±0.11肺与肌肉 0.97±0.22 1.12±0.30 0.98±0.17 0.95±0.21 0.86±0.14 0.31±0.09 0.80±0.26肝与肌肉 5.72±1.03 7.35±0.94 7.08±1.08 5.92±0.61 6.47±0.42 5.10±0.27 3.89±0.80脾与肌肉 1.46±0.12 1.71±0.18 1.34±0.09 1.01±0.06 0.96±0.20 0.55±0.14 0.89±0.11肾与肌肉 7.61±0.70 8.73±0.68 12.10±0.43 13.41±0.37 12.28±0.62 4.32±0.20 11.90±0.58胃与肌肉 0.81±0.19 1.31±0.22 0.90±0.15 0.76±0.26 0.55±0.11 0.34±0.17 0.69±0.20肠与肌肉 2.48±0.31 6.05±0.58 5.90±0.42 4.55±0.39 4.28±0.41 2.19±0.25 3.42±0.52

2.3 荷HePG2瘤裸鼠的SPECT显像

荷HePG2瘤裸鼠注射188Re-NGR后的SPECT显像示于图3。188Re-NGR在荷 HepG2瘤裸鼠中的 T/NT列于表 3。由表3可知,注射188Re-NGR后 1 h肿瘤即可显影,其中,肾、胃及肠道等组织摄取量较高,随时间延长,腹腔本底、血液及肌肉等组织摄取降低,肿瘤的摄取逐渐增多,T/NT也随之增高。12 h肿瘤T/NT为4.76,其显像最为清晰,24 h仍有显影。图3显示,在4～8 h显像清晰,竞争性抑制组注射188Re-NGR后肿瘤未显影。该结果表明,肿瘤对188Re-NGR的摄取是通过受体介导的特异性摄取。

图3 荷Hep G2瘤裸鼠188 Re-NGR SPECT显像

3 小 结

(1)本工作采用中间配体交换的方法进行188Re-NGR的制备,该反应时间短,易于完成,标记率可达85%,放化纯度＞90%,能够满足体内外受体研究要求,标记物在体外能稳定存放2 h。

(2)188Re-NGR主要通过肾脏代谢,部分经肠道代谢;在肿瘤组织中有明显摄取,且存留时间较长;抑制组对188Re-NGR的摄取明显低于实验组,且肿瘤部位不显像。以上结果说明,肿瘤对188Re-NGR的摄取是通过受体介导的特异性摄取。

(3)188Re-NGR注入荷瘤裸鼠体内后4 h即可显像。

188Re-NGR不仅可用于肿瘤显像,亦能为进行肿瘤治疗的适应征选择及疗效评价提供依据。

由于188Re的半衰期较短,可防止高能β射线对骨髓等正常组织可能引起的损伤,并可采用多次给药的方式以提高疗效。NGR可与多种药物耦联,可提高靶向性。因此,今后将着力进行188Re标记 NGR-IFN及NGR-VEGI等融合蛋白的肿瘤显像及治疗研究。

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