血清3,5,3'-三碘甲腺原氨酸酶联免疫分析试剂盒的研制

官国英,李丽波,刘忠瑞,许文革,韩世泉

(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京 102413)

3,5,3'-三碘甲腺原氨酸(T3)是甲状腺分泌的激素之一,相对分子质量为651。血液循环中的T3除小部分由甲状腺组织直接释放外,大部分由甲状腺素(T4)在组织中脱碘转化而来。T3与T4同受下丘脑-脑垂体-甲状腺轴的调节,并协同维持正常稳定的甲状腺功能,在机体的生长、发育、代谢及全身激素的平衡中起着重要的调节作用。

T3是诊断甲亢最灵敏的指标之一,它可以特异性地反映甲状腺的功能状态,对判断甲状腺功能紊乱有较高的应用价值[1-2]。目前临床检测T3的方法主要有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)和化学发光免疫(CLIA)。EIA具有灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、仪器简单经济等优点,是目前免疫分析理想的方法之一。

1 实验材料

1.1 主要仪器

酶标仪:奥地利SLT公司产品;GAMMAC12γ计数器:DPC公司产品;Cary 50 Probe紫外分光检测仪:美国Varian公司产品;电热培养箱:上海跃进医疗器械厂产品。

1.2 主要试剂

T3、生物素化试剂、链亲合素化酶、四甲基联苯胺(TMB)、脲素过氧化氢(H 2O2):均为美国Sigma公司产品,T3抗体、T 3-RIA(PR)试剂盒:原子高科股份有限公司产品。

2 实验方法

2.1 T3生物素化[3-4]

取T3钠盐用0.1 mol/L NaHCO3配制成1 g/L,在1 mL溶液中加入溶于30μL 20 g/L二甲基甲酰胺的生物素-N-羟基琥珀酰亚胺脂(BNHS)溶液,混匀,室温反应 1.5 h,用0.2 mol/L p H 7.4 PBS调pH为7.4,加入等体积甘油,-20℃贮存备用。

2.2 固相抗体的制备

向聚苯乙烯微量滴定板孔中按每孔100μL加入含有 T3抗体的 p H 9.6碳酸缓冲液,置4℃冰箱内过夜,37℃封闭1 h。此酶标板可用于免疫反应。

2.3 T3标准品的配制

称取0.5 mg T3,用0.1 mol/L NaOH溶液完全溶解,用紫外分光光度法测定其含量;用去激素血清对其进行稀释,配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/L的系列标准品。标准品经 T3-RIA校准,分装,4℃贮存备用。

2.4 底物溶液和终止剂

将TMB和H 2O2分别溶于p H 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中,控制其浓度分别为 0.6、1.2 mmol/L,使用时以体积比1∶1混合即为底物溶液。终止剂为2 mol/L H 2SO4溶液。

2.5 T3-生物素-ELISA(T3-BA-ELISA)分析程序

采取二步法加样程序:将50μL待测样品或标准品和50μL生物素化T3加入包被有T3抗体的微量滴定板中,混匀,37℃温育1 h,弃反应液,用洗涤液(含0.05%Tween-20)洗5次,以每孔100μL加入链亲合素化酶工作液,37℃温育0.5 h;弃反应液,用洗涤液洗 5次,按每孔100μL加入底物液。避光,在 37℃下显色15 min,用2 mol/L H 2SO4溶液按每孔50μL终止显色。采用酶标仪于450 nm处测定其光密度OD450。绘制标准曲线,计算样品中T 3含量。

3 结果与讨论

3.1 方法学建立

3.1.1 T3-BA-ELISA和T3-EIA的比较 T3-BA-ELISA和T3-EIA两种实验方案的标准曲线示于图1。图1显示,T3-BA-ELISA系统抑制曲线好,能更好地满足免疫分析要求。

图1 T3-ELISA与T3-BA-ELISA的比较□——T 3-ELISA;●——T3-BA-ELISA

3.1.2 T 3抗体包被浓度的选择 用p H 9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将T3抗体配制成0.5、1.0、2.0、3.0 、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L 工作液包被微孔,制备包被微孔板,用于 T3-BAELISA,实验结果示于图2。图2显示,包被浓度为10 mg/L时,标准点0.5、8.0μg/L与对应的0标准点的OD 450之比较大,抑制效果较好,可以满足免疫分析要求。

3.1.3 生物素化T3(T3-B)结合物的选择 采用不同的投料比(摩尔比)制备出3种 T3-B∶T3-B1(1∶1)、T3-B2(1∶1.5)和 T3-B3(1∶2),将这3种T3-B用于T3-BA-ELISA,结果示于图3。图3显示,T3-B3的0.5、4.0、8.0 μg/L 与对应的0μg/L的OD450之比较大,抑制效果较好,能满足免疫分析要求。

图2 抗体包被浓度□——0;●——0.5 μg/L;▲——8.0 μg/L

图3 T 3-B结合物的选择□— —0;●— —0.5 μg/L;▲— —4.0 μg/L;◆— —8.0 μg/L

3.2 方法学鉴定

3.2.1 标准曲线与灵敏度 按照 T3-BAELISA分析程序进行实验,以标准品的浓度为横坐标(对数坐标),OD450为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出 T3-BA-ELISA标准曲线,结果示于图 4。同时测定20个零标准的OD450,以其平均值减去2s计算其分析灵敏度为0.2μg/L。

3.2.2 精密度 重复测定3份含有不同T3浓度的人血清样品,观察批内、批间变异,结果列于表1。表 1显示,批内变异为7.1%～8.3%,批间变异为6.5%～10.5%,符合免疫分析要求。

图4 T 3-BA-ELISA标准曲线

表1 T3-BA-ELISA试剂盒的批内、批间变异

3.2.3 准确性 取3份不同T3浓度的血清样品分别加入已知浓度的 T3标准品中,测定T3回收率,结果列于表 2。表 2显示,回收率为98.1%～107.2%。该结果符合免疫分析要求。3.2.4 健全性实验 取T 3含量较高的人血清样品用T3“零”血清进行倍比稀释,并将其作为样品用于T3-BA-ELISA,结果示于图5。

表2 T 3-BA-ELISA回收实验

图5 T 3-BA-ELISA样品稀释实验

对图5数据进行线性拟合,相关方程为y=5.62x+0.18,相关系数 r=0.995 7,该结果符合免疫分析要求。

3.3 稳定性实验

将T3-BA-ELISA整体试剂盒分别于37℃下放置15、12、8、3 d,将各考验时间的整体试剂盒与4℃下存放的试剂盒同时用于 T3-BAELISA,结果示于图6。利用该试剂盒同时检测低、中、高浓度3份血清样品中 T3的含量,结果列于表3。图6显示,整体试剂盒分别于37℃下放置15、12、8、3 d与 4℃下保存的试剂盒对照,标准点OD450无显著性差异。表3显示,整体试剂盒在37℃下存放相同时间与4℃对照,3份血清样品的测量值无显著性差异。以上结果说明本工作所制得的试剂盒在37℃下的稳定性满足免疫分析要求。

图6 整体试剂盒的稳定性□— —0;●— —0.5 μg/L;▲— —4.0 μg/L;▼— —8.0 μg/L

3.5 正常参考值

测定78例健康体检人血清样品,正常参考值范围为0.9～2.2μg/L,与文献[5]结果基本一致。

表3 整体试剂盒37℃不同时间的血样测量值

4 小 结

本试剂盒通过方法学比较,引入生物素-亲合素系统,在抗体包被条件、生物素化试剂的选择等方面进行了探索,找到了合适的免疫反应体系,完成了T 3-BA-ELISA试剂盒的研制工作。

[1] 王坤,李广宙,王怀全.甲亢患者131I治疗前后血清性激素水平观察[J].国外医疗,2009,23:6-7.

[2] 崔素珍,韩世泉,官国英,等.游离三碘甲腺原氨酸(FT3)生物素-亲合素酶联免疫分析[J].同位素,2004,17(1):39-42.

[3] 官国英,韩世泉,王玉肖,等.高灵敏度人促甲状腺激素(hTSH)酶联免疫分析试剂盒[J].原子能科学技术,2002,36(2):129-133.

[4] Diamandis EP,Christopouls TK.The biotin-(Strept)avidin system:principles and applications in biotechnology[J].Clin Chem, 1991, 37:625-636.

[5] 蔡锡麟,陈耀华,秦明秀,等.临床放射免疫学[M].北京:原子能出版社,1994:135.