姜黄素改善丝裂霉素C导致的肾功能损伤

周钱梅，苏式兵

(上海中医药大学中医复杂系统研究中心，上海 201203)

姜黄素(curcumin)是以传统中药材姜黄为原料，提取精制而得的食用天然黄色素。它被报道具有肿瘤细胞增殖抑制［1］等抗肿瘤作用，并对顺铂的化疗毒性作用有一定的防护效果［2］。研究发现，姜黄素能够通过抑制糖调节蛋白P58介导的丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)与DNA的交联，减少MMC抗肿瘤的毒性作用［3］，MMC是一种细胞周期非特异性广谱抗瘤药物，可使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制癌细胞分裂［4］。由于MMC抗癌治疗易引起耐药性，且伴随着诸如肾功能损害、骨髓抑制等毒副作用［5］，只能作为乳腺癌治疗的三线化疗药物。化学预防治疗是指应用相对无毒的天然或合成的药物干预癌症发生、发展的各个阶段，能降低癌症的危险性，且已呈现出良好的发展前景［6］。姜黄素是一种相对低毒的植物衍生的多酚类化合物，具有潜在化学预防作用。已有研究报道，姜黄素与顺铂联合应用后使一些肿瘤相关的酶趋于正常化，其可作为顺铂化疗药物很好的辅助治疗药物［7］。但对其如何减少MMC抗肿瘤肾毒性的机制缺乏研究。本研究将姜黄素和不同浓度MMC联合用药与单独使用MMC比较，观察肿瘤生长被抑制状态下，移植瘤鼠肾功能损伤状况，并检测MMC在肾的分布，探讨姜黄素改善MMC所致肾功能损伤及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

姜黄素购自中国药品生物制品检定所。MMC购自美国ICN公司。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国PAA公司。牛胰岛素购自美国Sigma公司。二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，血肌酐(creatinine，Cre)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Survyor型液相色谱仪及LCQ DECA XPplus质谱仪购自美国Finnigan公司。SEVAP系列氮吹仪购自美国Organomation公司。Synergy2酶联免疫检测仪购自美国BioTek公司。

1.2 细胞培养及乳腺癌异种移植瘤裸鼠模型的制备

MCF-7细胞由中国科学院健康所荆清课题组惠赠。MCF-7细胞种植在RPMI 1640培养基(含10%FBS，胰岛素 0.01 g·L－1，青链霉素 100 kU·L－1混合液，HEPES 20 mmol·L－1)中，细胞在 37℃ 5%CO2环境中单层生长。

将人乳腺癌MCF-7细胞1×1010L－1接种于雌性裸鼠的乳房颊脂垫。在接种细胞前24 h，裸鼠ip给予苯甲酸雌二醇5 g·kg－1，每隔5 d补加1次，共14 d。

1.3 动物分组与给药

以DMSO溶解姜黄素粉末，配制成40 mmol·L－1溶液(储存液)，置 4℃ 冰箱保存，临用时稀释成所需浓度(DMSO终浓度＜0.1%)。MMC以生理盐水溶解，配制成1 mmol·L－1溶液(储存液)，置4℃避光保存。

BALB/c裸鼠72只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005，7周龄，雌性，体质量19～23 g，上海中医药大学动物实验中心SPF实验室饲养。在造模2周后，除正常对照组外，移植瘤裸鼠被随机分为模型组;姜黄素100 mg·kg－1组，ip 给予 0.2 ml，隔天给药 1 次;MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1组，每隔 5 d 给药 1 次;姜黄素 +MMC组，同时给予两药，给药频率同各单独用药频率。给药4周后眼眶取血，800×g离心3 min分离血清备Cre和BUN检测。取血后即刻行颈脱位法处死小鼠，解剖后取瘤块，称其质量，取肾组织检测药物分布量。

1.4 观察动物体质量及存活情况

实验动物按其体质量随机分组，分别于造模前、给药前及给药结束后称体质量，本实验仅比较给药结束后各组实验动物的体质量。实验整个过程中记录各组实验动物的死亡数目，计算各组实验动物的存活率。

1.5 测定肿瘤质量

实验动物给药4周，颈脱位法处死小鼠后，在接种乳腺癌细胞MCF-7处原位解剖取瘤块称重。

1.6 检测血清肌酐

取血清0.1 ml加入钨酸蛋白沉淀剂1 ml，充分混匀，800×g离心10 min，取上清按Cre检测试剂盒说明书进行测定，测定吸光度(absorance，A)并按以下公式计算血清 Cre含量:血清 Cre(μmol·L－1)=(A测定管－A空白管)/(A标准管－A空白管)× 标准管浓度(10 μmol·L－1)×11。

1.7 检测血清尿素氮

取血清 0.05 ml加入2.5 ml肟溶液1 g·L－1、酸溶液2.5 ml，混匀，置沸水中15 min，立即用自来水冷却。使用酶联免疫检测仪，测定A值后，按以下公式计算血清 BUN含量:BUN(mmol·L－1)=(A测定管－A空白管)/(A标准管－A空白管)×标准品浓度(10 mmol·L－1)×样本测试前的稀释倍数。

1.8 液质联用仪检测肿瘤组织中的药物分布

姜黄素和MMC的质谱条件:Survyor型液相色谱仪及LCQ DECA XPplus质谱仪配有ESI离子化源和离子阱质量分析器，Xcalibur1.3 workstation数据处理系统。色谱柱:Agilent Zorbax Extend-18栓(2.1 mm×150 mm，5 μm);流动相:色谱甲醇和超纯水;流速:0.3 ml·min－1;柱 温:30℃;进 样 量:2 μl(MMC:5 μl)。上机实验条件，ESI界面:阳离子模式;毛细管温度:姜黄素270℃，MMC 310℃;喷雾电压:姜黄素5 kV，MMC 4 kV;毛细管电压:姜黄素26 V，MMC 7 V;鞘气流(N2):姜黄素10 AU，MMC 32 AU;辅助气流(N2):姜黄素0 AU，MMC 15 AU。表1为时间-流动相组成梯度。

表1 液质联用仪检测姜黄素与丝裂霉素C(MMC)的流动相梯度Tab.1 Chromatographic gradient for analysis of curcumin and mitomycin C(MMC)

1.9 色谱法检测肾组织丝裂霉素原型药物分布

取0.2 g肾组织，生理盐水匀浆后，2200×g离心10 min后取全部上清，加入5倍体积的甲醇，2200×g离心10 min，取全部上清，氮吹仪将其吹干浓缩，再在40℃水浴上以 50% 甲醇-水溶剂溶解成 200 μl，20 000×g离心15 min，取上清，用于色谱检测。

1.10 统计学分析

等效线图解法分析药物联合应用的效应。用公式q=E(AB)/［EA+(1 －EA)×EB］［4］计算 q值，判定两药合用是否增效。其中，E(AB)为两药合用的抑制率，EA和EB为两药单用的抑制率，q=0.85～1.15表示两药作用相加，q＞1.15表示两药作用协同，q＜0.85表示两药相互拮抗。

2 结果

2.1 姜黄素与丝裂霉素联合对动物体质量及存活率的影响

小鼠给予 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1出现食欲缺乏和体质量减轻。MMC 2 mg·kg－1组体质量较模型对照组减轻了38%(表2)。姜黄素100 mg·kg－1+MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1联合用药组的小鼠食欲正常，与单独给与 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1组比较，体质量分别增加了12%，24%和18%(P＜0.05)，与正常对照组比较无显著性差异(表2)。MMC 2 mg·kg－1组存活率为 4/8，MMC 1.5 mg·kg－1组存活率为7/8，而姜黄素 100 mg·kg－1+MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1联合用药组则无死亡，存活率均为8/8。

表2 姜黄素与MMC联合对BALB/c裸鼠体质量的影响Tab.2 Effect of curcumin combined with MMC on body mass of BALB/c nude mice

2.2 姜黄素与丝裂霉素联合对肿瘤生长的影响

如表3所示，与模型对照组比较，MMC 1 mg·kg－1对肿瘤大小无明显影响;单独给予姜黄素或MMC 1.5 和2 mg·kg－1后肿瘤质量比模型组分别减少了44.2%，64.5%及 84.5%;姜黄素联合 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1组的肿瘤质量分别减少了 40.9%，86.5%和82.7%，均有显著性差异(P ＜0.05)。其中，姜黄素 +MMC 1.5 mg·kg－1显著抑制裸鼠肿瘤的生长，表现为协同抑瘤作用(q=1.17)。

2.3 姜黄素与MMC联合对小鼠肾功能的影响

表4结果显示，与模型组比较，MMC 1，1.5和2mg·kg－1血清中 Cre水平分别升高了14%，27%和82%，BUN水平分别升高了37%，52%和54%，差异显著(P＜0.05)，表明MMC对肾功能有损伤作用。分别与相应单用MMC组比较，姜黄素+MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1联合用药后，Cre 水平分别降低了19%，25%和43%，BUN水平分别降低了37%，41%和34%，差异显著(P＜0.05)。提示姜黄素与MMC联合用药后改善了MMC所致的肾功能损伤。

表3 姜黄素与MMC对BALB/c裸鼠肿瘤质量的影响Tab.3 Effect of curcumin combined with MMC on tumor mass of BALB/c nude mice

表4 姜黄素与MMC联合对BALB/c裸鼠血清肌酐(Cre)及血清尿素氮(BUN)的影响Tab.4 Effect of curcumin combined with MMC on levels of serum creatinine(Cre)and blood urea nitrogen(BUN)in BALB/c nude mice

2.4 姜黄素对丝裂霉素肾分布量的影响

姜黄素与MMC的检测均采用选择离子模式。姜黄素标准品的出峰时间为8.57 min，在质荷比为367.3出现分子离子峰。MMC标准品的出峰时间为11.10 min，在质荷比为357.3出现分子离子峰。

在姜黄素与不同剂量MMC联合用药组小鼠肾组织中均检测到姜黄素和MMC原型药物(表5)。其中，单独用MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1组中MMC 原型药物的分布量分别为(11.2 ±5.5，19.9 ±5.2 和33.5 ± 3.9)g·g－1，而姜黄素 +MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1组中MMC原型药物的分布量分别为(0.99±0.53，2.34 ±1.73 和 5.2 ±1.05)g·g－1。与相应的单药组比较，姜黄素与MMC联合用药后，肾组织中MMC的分布量分别减少了91%(P＜0.01)，88%(P ＜0.01)和84%(P ＜0.01)，提示 MMC 与姜黄素联合用药后，MMC的肾分布量减少。

表5 姜黄素对MMC在BALB/c裸鼠肾分布量的影响Tab.5 Effect of curcumin on MMC distribution in BALB/c nude kidneys of mice

3 讨论

本实验结果显示MMC 2 mg·kg－1抑制了MCF-7细胞异种移植瘤裸鼠体内肿瘤的生长，然而其也表现了实验动物致死的毒性，该组实验动物死亡一半，且余下的一半的实验动物也表现出了明显的毒性作用，如食欲缺乏，体质量减轻，出现了明显的肾功能损伤。姜黄素 100 mg·kg－1与 MMC 1.5 mg·kg－1联合用药组实验动物全部存活，且降低了MMC的用药剂量，逆转了MMC引起的肾功能损伤，提高了实验动物的生存率和生存质量。研究发现，MMC单独处理 MCF-7 细胞的 IC50浓度为 5 μmol·L－1，将其与IC50浓度的姜黄素联合应用时，其IC50浓度降至1.5 μmol·L－1。可见，姜黄素与 MMC 联合用药后MMC达到相同的半数抑制效应的浓度显著降低，我们将进一步探讨姜黄素与MMC联合应用对肾原代细胞生长的影响与毒性。

肾代谢药物的能力不仅与药物消除速度有关，而且与药物或毒物肾内浓度有关［8］。化疗药物在靶器官的浓聚，会增加其对靶器官的损伤，造成不良反应。本研究发现，姜黄素与不同剂量MMC联合用药在减轻肾功能损伤的同时，肾组织中检测到的MMC的含量明显低于MMC组，提示姜黄素能显著降低MMC肾中的分布水平，这可能是姜黄素改善MMC肾毒性的原因之一。

本研究表明，姜黄素可以减少MMC抑制肿瘤的用药量，并能够通过减少MMC在肾的分布，降低肾毒性，为中西药结合治疗肿瘤的增效减毒研究提供思路和实验依据。

［1］ Kim KH，Park HY，Nam JH，Park JE，Kim JY，Park MI，et al.The inhibitory effect of curcumin on the growth of human colon cancer cells(HT-29，WiDr)in vitro［J］.Korean J Gastroenterol，2005，45(4):277-284.

［2］ 李昱辰，仲来福.姜黄素对顺铂所致大鼠肾毒性的防护作用［J］.毒理学杂志，2006，20(2):91-93.

［3］ Zhou QM，Zhang H，Lu YY，Wang XF，Su SB.Curcumin reduced the side effects of mitomycin C by inhibiting GRP58-mediated DNA cross-linking in MCF-7 breast cancer xenografts［J］.Cancer Sci，2009，100(11):2040-2045.

［4］ Volpato M， Seargent J， Loadman PM， Phillips RM.Formation of DNA interstrand cross-links as a marker of mitomycin C bioreductive activation and chemosensitivity［J］.Eur J Cancer，2005，41(9):1331-1338.

［5］ Wu HI，Brown JA，Dorie MJ，Lazzeroni L，Brown JM.Genome-wide identification of genes conferring resistance to the anticancer agents cisplatin，oxaliplatin，and mitomycin C［J］.Cancer Res，2004，64(11):3940-3948.

［6］ Campbell FC，Collett GP.Chemopreventive properties of curcumin［J］.Future Oncol，2005，1(3):405-414.

［7］ Navis I， Sriganth P， Premalatha B. Dietary curcumin with cisplatin administration modulatestumour marker indices in experimental fibrosarcoma［J］.Pharmacol Res，1999，39(3):175-179.

［8］ 苏成业.肾脏的药物代谢与肾脏病时药代动力学的改变［J］.中国临床药理学杂志，1986，2(4):244-250.