cAMP-PKA信号通路对L02细胞药物代谢酶CYP3A的调控作用

李 敏，张 冰，刘小青

(1.陕西中医学院药学院，陕西咸阳 712046;2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)

肝是机体药物代谢的主要器官，大多数药物都要经过肝代谢酶作用发挥效应，其中细胞色素P4503A(cytochrome P4503A，CYP3A)是最主要的药物代谢酶。CYP3A的活性直接影响药物对机体的治疗作用及毒性反应［1］。CYP3A表达主要通过核受体孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)调控［2］。cAMP-PKA信号通路介导体内多种信号传导，该信号通路可能调节 CYP3A 的表达［3］。8-Br-cAMP和 H-89 分别是cAMP-PKA信号通路的激动剂和抑制剂，本实验研究8-Br-cAMP及H-89作用于L02细胞，观察CYP3A的变化，研究CYP3A的表达机制，探讨该信号通路对药物代谢酶的影响。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

L02细胞由北京中医药大学中药学院生物技术系王春梅老师惠赠。锥虫蓝(MTT)，8-Br-cAMP和H-89均购自美国Sigma公司;RPMI1640培养基(干粉)、胎牛血清、D-Hanks均购自美国Gibco公司;无水甲醇、磷酸二氢钾、磷酸、异丙醇均为分析纯，购自北京化学试剂公司。胰酶、青霉素和链霉素购自Gibco公司。

超净工作台(天津医药净化设备厂);CO2细胞培养箱(美国Nap-co公司);Bio-Rad-550酶标仪(美国Metertech公司);低温高速离心机、Nikon生物显微镜和NIS图像采集分析系统(日本Nikon公司);电泳仪和转膜机(美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养及MTT法［4］检测L02细胞活性

液氮罐中取出冻存的L02细胞株，复苏培养，培养基为 1640(含 10%FCS，青霉素100 kU·L－1，链霉素100 kU·L－1)，置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，24 h后更换培养基，细胞为单层贴壁生长，当细胞贴壁大于85%时(对数生长期)可传代培养。

细胞传至第四、五代状态较好时，调整细胞密度108L－1，培养12 h后，大于85%的细胞贴壁，吸出原培养基，按组别分别加入含药的无血清培养基，每孔加入 100 μl浓度为 10－3，10－4，10－5，10－6，10－7，10－8和10－9mol·L－1的 8-Br-cAMP 或 H-89 溶液，设5 个复孔，培养48 h，每孔加20 μl MTT 溶液5 g·L－1(pH=7.4)。继续孵育4 h后，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加二甲亚砜150 μl，微量振荡器振荡10 min，在波长 570 nm酶标仪测定吸光度(absorbance，A)值，观察8-Br-cAMP和H-89对细胞活力的影响。

1.3 L02细胞分组处理

L02细胞108L－1，接种于12孔板，正常对照组，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1组，H-89 10 μmol·L－1组，培养48 h后收集细胞，检测相关指标，每组设3个平行，重复3次，测PKA的培养孔中放入圆形盖玻片，细胞爬片后做免疫组化用。

1.4 免疫组化法检测PKA表达

有盖玻片的培养板小心吸去培养液，加入4%的多聚甲醛，4℃，固定24 h。取出盖玻片，依次用PBS漂洗3×5 min，3%的H2O220 min。① 兔抗PKA抗体稀释液(1∶100，武汉博士德)孵育24 h(4℃)，37℃复温40 min，PBS漂洗3×5 min;②二抗羊抗兔IgG 37℃ 40 min，PBS漂洗 3×5 min;③ DAB 显色。常规脱水、透明、封固，光镜下观察并拍摄照片。采用图像分析系统测定PKA阳性免疫反应产物的积分灰度值(着色深者灰度值低)进行分析。

1.5 Western印迹法检测PXR表达

小心倾去培养液，用PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集细胞，126×g离心5 min，小心吸出上清液，PBS再清洗，126×g离心5 min，倒净 PBS，加入200 μl裂解液(1.4 ml单去污剂裂解液和 20 μl PMSF)，冰上裂解 30 min，4℃，13 427×g离心 8 min，吸取约 170 μl，－80℃保存待测。

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，每孔加40 μl蛋白，采用SDS-PAGE电泳，13%分离胶，5%的浓缩胶，半干转膜法将蛋白转至PVDF膜上，0.5%脱脂奶粉封闭1 h后加入β肌动蛋白一抗4℃过夜(1∶2000)。用含吐温-20的PBS(PBST)洗涤3次，每次5 min，加入二抗，密封，室温1 h，PBST液洗3次，加入PXR 一抗(1∶150)，室温1 h，PBST 液洗3 次，加二抗，PBST液洗3次，加显色剂2 min，在暗室内压胶片曝光，观察结果并扫描分析。PXR表达水平用目的条带积分吸光度值(integrated absorbance，IA)与内参β肌动蛋白条带的IA比值定量表示。

1.6 红霉素-N-脱甲基法检测CYP3A的活性

倾去培养液，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集细胞，4023×g离心10 min，吸出上清液，加入0.2 ml pH 7.4的甘油磷酸缓冲液重悬细胞，用超声破碎仪破碎细胞，1450×g，4℃离心15 min，取上清液，按照红霉素-N-脱甲基法检测CYP3A的活性［5］。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 8-Br-cAMP和H-89对L02细胞活力的影响

与正常对照组比较，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1使细胞活性明显降低(P ＜0.05)，H-89 1 和 0.1 mmol·L－1使细胞活性明显降低 (表 1)。所以8-Br-cAMP和H-89选择对细胞没有损害的10 μmol·L－1作为实验浓度。

表1 8-Br-cAMP和H-89对L02细胞活力影响Tab.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of L02 cells

2.2 8-Br-cAMP和H-89对L02细胞PKA表达的影响

如图1所示，PKA主要分布在胞浆之中，免疫组化染色后，可发现细胞胞浆中分布着棕黄色阳性颗粒。正常对照组有部分阳性细胞，胞浆分布有棕黄色颗粒，正常对照组PKA表达灰度值211±20相比，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1组阳性细胞数较多，且阳性颗粒着色较深，其阳性面积及PKA表达灰度值(296±18)明显增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，H-89 组阳性细胞数较少、颗粒着色也比较浅，PKA表达灰度值(176±14)显著降低(P ＜0.05)。

2.3 8-Br-cAMP和H-89对L02细胞PXR表达的影响

与正常对照组比较，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于细胞后，细胞PXR表达明显增强(P＜0.05)，而 H-89 10 μmol·L－1组 PXR 表达没有明显差异(图2)。

图18-Br-cAMP和H-89对L02细胞PKA蛋白表达影响 (×400).A:正常对照组;B:8-Br-cAMP 10 μmol·L－1组;C:H-89 10 μmol·L－1组.Fig.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PKA in L02 cells(×400).

图2 Western印迹法检测8-Br-cAMP和H-89对LO2细胞孕烷X受体(PXR)表达的影响.1:正常对照;2:8-Br-cAMP 10 μmol·L － 1;3:H-89 10 μmol·L －1 .Fig.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PXR in L02 cells detected by Western blotting.

2.4 8-Br-cAMP和 H-89对 L02细胞 CYP3A活性的影响

与正常对照组比较，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于L02细胞后，细胞CYP3A活性明显增强(P＜0.05)，H-89 10 μmol·L－1组细胞 CYP3A 活性无明显差异(表2)。

表28-Br-cAMP和H-89对L02细胞中CYP3A活性的影响Tab.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of CYP3A in L02 cells

3 讨论

肝药物代谢酶的表达及活性变化直接影响药物的体内过程，使药物血药浓度变化，对机体产生不同的生物学效应。CYP3A是肝Ⅰ相药物代谢酶中较为重要的代谢酶，介导临床60%药物的代谢，与药物效应密切相关，CYP3A的表达主要由上游因子PXR调控。cAMP-PKA信号通路介导机体多种生物效应［6］，与 CYP3A 的表达也密切关联［3］。

本研究通过体外实验，观察cAMP-PKA信号通路药物代谢酶CYP3A的调控作用。L02细胞是体外培养的正常人类肝脏细胞，肝脏是药物代谢酶存在的主要器官，因此L02细胞中有较完整的肝脏药物代谢酶系，可作为体外实验考察肝脏药物代谢酶变化合适的细胞株。故实验选用L02细胞，考察cAMP-PKA通路激动剂8-Br-cAMP、抑制剂H-89对L02细胞中CYP3A及PXR的影响，探讨cAMP-PKA通路对CYP3A的调控的机制［7－8］。

实验应用 MTT［8］法观察8-Br-cAMP，H-89对细胞活性的影响，选择合适的实验浓度。结果显示，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1有一定的细胞毒性，随着浓度降低，对细胞损害越小，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1及更低的浓度时，对细胞基本没有损害，故选用8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作为实验浓度。同样选择 H-89 10 μmol·L－1作为实验浓度。

8-Br-cAMP 和 H-89 10 μmol·L－1作用于 L02 细胞后，PKA，PXR和CYP3A都发生变化。8-Br-cAMP 10 μmol·L－1，可以增强细胞中 PKA 和 PXR 表达，并上调 CYP3A 的活性，可见 8-Br-cAMP 10 μmol·L－1可以上调cAMP-PKA通路，并能增强PXR表达，从而使CYP3A 活性增强。H-89 10 μmol·L－1使 L02 细胞的PKA表达降低，对细胞的PXR表达、CYP3A的活性影响不大。可见，cAMP-PKA信号通路处于上调状态时可以增强PXR表达，从而增加CYP3A的活性，说明cAMP-PKA信号通路可以调控CYP3A的表达。H-89 10 μmol·L－1使 cAMP-PKA 信号通路处于抑制状态，PKA表达下降，PXR蛋白表达和CYP3A活性无明显改变，说明cAMP-PKA信号通路抑制时，可能存在其他途径诱导PXR介导的CYP3A的表达，其综合效应使PXR蛋白表达和CYP3A活性无明显变化，可见，除了cAMP-PKA信号通路，同时可能还有其他途径共同调控CYP3A的表达。

cAMP-PKA信号通路在CYP3A表达中有积极意义，是影响CYP3A表达的途径之一，进一步实验宜从基因和蛋白层次观察该通路对CYP3A表达的影响。可见，通过干预机体cAMP-PKA信号通路，影响CYP3A表达，可改变机体药物代谢水平，为研究影响药效的深层次机制提供实验依据。

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