万胜化风丹、雄黄和朱砂的急性肝肾毒性作用

颜俊文，苗加伟，何海洋，时京珍，吴 芹，刘 杰，石京山

(1.贵州省基础药理重点实验室，遵义医学院药理教研室，贵州遵义 563003;2.贵阳中医学院实验中心基础医学实验室，贵州贵阳 550002)

万胜化风丹由天麻、僵蚕、全蝎、天南星、荆芥、雄黄、药母、麝香、朱砂、硼砂、巴豆霜和冰片等15味中药经独特的下窖发酵及风干工艺制作而成的传统中成药，用于风痰闭阻(头痛、耳鸣、脑动脉硬化、肢体麻木无力及脑萎缩)，中风偏瘫，癫痫，面神经麻痹，口眼歪斜等症的治疗，1951年被列入国务院保护的四大名药之一。

万胜化风丹原方含雄黄和朱砂约10%，众所周知，雄黄和朱砂为砷和汞化合物，近年来，其安全性问题备受关注，因此，在原方基础上，雄黄、朱砂用量减少了约2/3。但减量方疗效下降，其毒性变化未知。为了进一步探究雄黄、朱砂及其在万胜化风丹中的肝、肾毒性，本研究采用一次性ig给予万胜化风丹原方药、雄黄和朱砂减量的万胜化风丹(减量方药)、不含雄黄和朱砂的万胜化风丹(减方药)、与原方药等量的雄黄和朱砂单药、亚砷酸钠和氯化汞，比较其肝肾毒性，为客观评价含雄黄和朱砂中药的肝肾毒性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品

万胜化风丹原方药、减量方药和减方药均由贵州万胜药业公司提供。雄黄和朱砂购自贵州德昌祥药厂。

1.2 试剂和主要仪器

Trizol:宝生物工程(大连)有限公司，焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC):Sigma公司，SYBR®GREEN PCRMaster Mix，ABI公司，逆转录试剂盒:宝生物工程(大连)有限公司。自动血生化检测仪(日本Olympus公司);Lido-49型原子荧光光谱仪(北京科创海光仪器有限公司);实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪，美国 Bio-Rad公司;TU-1810紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机，22331多功能梯度PCR仪，德国Eppendorf公司。

1.3 动物分组及方法

昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量(20±2)g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，合格证号:0002438。

48只昆明种小鼠随机分成8组，每组6只。正常对照组给予蒸馏水;万胜化风丹原方药3 g·kg－1、减量方药3 g·kg－1(雄黄和朱砂用量减少了约2/3)、减方药 3 g·kg－1，雄黄 0.3 g·kg－1组(与原方药含汞量相当)，朱砂 0.3 g·kg－1组(与原方药含汞量相当)，亚砷酸钠 36 mg·kg－1组(原方药含砷量的10%)和氯化汞 0.07 g·kg－1组(原方药含砷量的20%)。各组均一次性ig给药。

1.4 血液生化指标的检测

小鼠ig给药后8 h后断头处死，取血，2500×g离心10 min，自动血生化检测仪检测血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，肌酐(creatinine，Cre)水平。

1.5 测量肝、肾组织中As和Hg含量

取肝，肾组织各约100 mg，分别放入消化罐中，用刻度吸管加入65%H2NO35 ml，置烤箱中165℃消化2 h。自然冷却后，将消化罐内液体倒入50 ml刻度管中并用去离子水定容到25 ml，混匀。从50 ml刻度管取5 ml样品消化液入另一试管，在此试管加入1 ml 5% 硫脲-抗坏血酸溶液混合，反应30 min，用原子荧光光谱仪检测砷和汞含量。

1.6 HE染色观察肝肾组织病理变化

取肝中叶适当大小，肾纵切后的1/2迅速放入4%多聚甲醛中固定，送病理科石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下采集图像。

1.7 RT-PCR法检测肝、肾组织金属硫蛋白基因metallothionein 1(MT-1)mRNA表达

取肝、肾组织各50～100 mg，按PCR试剂盒操作提取mRNA，纯化，逆转录，荧光定量PCR仪检测基因表达。引物由宝生物工程有限公司设计并合成，MT-1同义链:5'-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3'反义链:5'-GCTGGGTTGGTCCGATACTATT-3'。用2△Ct法定量数据结果。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对肝肾功能的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，亚砷酸钠36 mg·kg－1ALT 增高，朱砂 0.3 g·kg－1、氯化汞 0.07 g·kg－1组Cre和BUN均明显增高，有统计学差异(P ＜0.05);与原方药组相比，氯化汞 0.07 g·kg－1Cre和BUN显著增高(P＜0.05);说明了亚砷酸钠对肝有损害，氯化汞对肾有损害。

2.2 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对肝肾组织中砷、汞蓄积的影响

表2结果显示，与正常对照组相比，除减方组与雄黄0.3 g·kg－1外，其余各组肝肾组织中砷的蓄积量明显增高，有统计学差异(P＜0.05);与原方药组相比，亚砷酸钠36 mg·kg－1肝肾组织中砷的蓄积量明显增高，有统计学差异(P＜0.05)，表明肝肾组织中砷的蓄积量与化风丹中雄黄含量的高低直接相关，万胜化风丹比单用雄黄更易引起砷在肝肾的蓄积，说明复方与单味药之间的差异，尽管亚砷酸钠组砷的用量只有原方药的10%，砷在肝肾组织中的蓄积却是原方药的5倍，说明不同价态的砷在体内分布是有显著差别的。

表1 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对小鼠肝肾功能的影响Tab.1 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on hepatic and renal function of mice

表2 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药在肝肾组织中砷蓄积的影响Tab.2 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on arsenic accumulation in the liver and kidneys of mice

表3结果显示，与正常对照组相比，除减方药外，其他各组肝、肾组织汞的蓄积量增加，有统计学差异(P＜0.05);与原方药组相比，氯化汞0.07 g·kg－1引起汞在肝肾组织中蓄积增加，有统计学差异(P ＜0.05)，朱砂0.3 g·kg－1组肾汞蓄积增加，有统计学差异(P＜0.05)。说明复方中的汞比朱砂单用易于在肝内蓄积，而朱砂单用比复方中的汞更易在肾蓄积，氯化汞比其他各组更易引起肝肾组织中汞的蓄积，以肾组织中汞蓄积量最多。

表3 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对肝肾组织中汞蓄积的影响Tab.3 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on mercury accumulation in the liver and kidneys of mice

2.3 胜化风丹原方药、减量方药和减方药对肝肾组织的病理损伤

由图1可知，正常对照组肝组织染色均匀，细胞排列整齐有序。与正常对照组(图1A)相比，亚砷酸钠组(图1D)、氯化汞组(图1F)肝细胞肿胀、嗜酸性变性、点状细胞凋亡和坏死;而万胜化风丹原方药组(图1B)、雄黄组(图1C)、朱砂(图1E)组病变轻微。

图1 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对小鼠肝组织损伤的病理影响 (HE ×200).A:正常对照;B:万胜化风丹原方药 3 g·kg－1;C:雄黄 0.3 g·kg－1;D:亚砷酸钠 0.036 g·kg－1;E:朱砂0.3 g·kg－1;F:氯化汞0.07 g·kg－1.Fig.1 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on pathological morphology in liver of mice(HE ×200).

图2 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对小鼠肾损伤的病理影响(HE ×200).A:正常对照组;B:万胜化风丹原方药 3 g·kg－1组;C:雄黄 0.3 g·kg－1组;D:亚砷酸钠 0.036 g·kg－1组;E:朱砂0.3 g·kg－1组;F:氯化汞0.07 g·kg－1组.Fig.2 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on pathological morphology in kidneys of mice(HE ×200).

由图2可见，正常对照组(图2A)肾脏肾小球完整，肾小管清晰可见。与正常对照组相比，亚砷酸钠组肾小球萎缩，间质炎症反应(图2D);氯化汞组肾小管管腔细胞肿胀，空泡变性，可见点状细胞凋亡和坏死(图2F)，而万胜化风丹组(图2B)、雄黄组(图2E)、朱砂组(图2C)病变轻微。

2.4 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对小鼠肝MT-1 mRNA表达的影响

由表4可知，减方药组、亚砷酸钠组及氯化汞组的肝MT-1 mRNA水平均显著增高，分别为正常对照组的2倍、4倍和10倍(P＜0.01)。亚砷酸钠组及氯化汞组的肾MT-1 mRNA水平均显著增高，分别为正常对照组的3倍和7倍。亚砷酸钠组(相当于原方药组含砷量的10%)，氯化汞组(相当于原方药组含汞量的20%)引起了肝肾应激反应。亚砷酸钠应激反应强于雄黄，氯化汞也强于朱砂。

表4 万胜化风丹原方药、减量方药和减方药对小鼠肝金属硫蛋白(MT-1)mRNA表达的影响Tab.4 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on expression of metallothionein 1(MT-1)mRNA in liver and kidneys of mice

3 讨论

本实验结果显示，万胜化风丹减方药，减量方药，原方药中雄黄、朱砂含量依次递增，小鼠ig给予8 h后，砷汞在肝肾中蓄积量也依次增高，但是血清肝、肾生化指标和病理均没有明显的改变，提示无明显肝肾功能异常。虽然亚砷酸钠组砷的摄入量只有万胜化风丹原方药组的10%，却引起了肝肾组织砷蓄积的显著增高(5倍)，并且引起肝肾病理损伤和血清转氨酶升高。氯化汞组大鼠汞的摄入量仅为万胜化风丹原方药的20%，也引起了肝肾组织汞的显著蓄积和肝、肾病理损伤及BUN升高，由此可知，亚砷酸钠和氯化汞的毒性远大于雄黄和朱砂。万胜化风丹3 g·kg－1用量相当于临床用量的7.5倍，在此剂量下，一次性给药未见明显肝肾毒性。砷毒性取决于其化学物结构、氧化状态和其代谢途径，而不同砷化合物的毒性可相差百倍、甚至于千倍。如某些海鲜含砷量高于砒霜含砷量上千倍，但可食用［3］。金属汞、无机汞和有机汞的毒性也不宜用总汞的含量来衡量，微量的二甲汞可致死，而大量的朱砂则不一定致死［4］。

一些研究发现，复方中的药物可以减少砷和汞从雄黄和朱砂释放［7］，但本实验观察到不同的结果。雄黄组虽然与原方药组含砷相当，但是雄黄组较原方药组引起的肝和肾砷蓄积少，说明万胜化风丹复方可以促进雄黄中砷的生物利用度;朱砂组较原方药组引起的肝汞蓄积少，但是较原方药组肾汞蓄积量多，说明万胜化风丹复方对朱砂中汞的释放具有组织特异性。中药配方有君、臣、左、使的关系，也说明砷、汞在一定剂量范围内，有特定的药理作用，这亟待进一步研究。

MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，并且参加其功能调节。MT的巯基能强烈螯合有毒金属，从而实现解毒功能。MT通过与重金属结合可以有效地减轻重金属对机体的毒害，是对金属暴露和随之产生的毒性最敏感的生物标志［2，10，16－18］。

前期研究发现，小鼠染毒8 h后，MT mRNA升高是可以作为金属暴露和毒性的生物标志，而雄黄和朱砂对 MT的诱导远低于常见的砷、汞化合物［16－17］。与万胜化风丹一样，急性给予六神丸、安宫牛黄丸及雄黄、朱砂后产生的砷、汞蓄积和肝、肾毒性均远低于亚砷酸钠和氯化汞，说明雄黄和朱砂的毒性作用不能用亚砷酸钠和氯化汞替代说明［16－17］。

砷毒性效应的大小与摄入人体的剂量、时间及途径有关，也与砷的价态有关。无机砷(3价)化合物能与蛋白质中的巯基作用，毒性较大，砷化合物毒性顺序为:AsH3＞As3+＞ As0＞As5+＞ As4S4(雄黄)［3，6］。在本实验中，亚砷酸钠引起了 ALT 的升高、肝肾病理损伤，而雄黄未见明显毒性，这可能是因为亚砷酸钠比雄黄更易进入肝肾组织，所以其在组织中蓄积远高于雄黄。同样，本实验结果显示，朱砂毒性远小于氯化汞，因为朱砂的溶解度与生物利用度都很低，在20℃时，氯化汞在水中溶解度是30～70 g·L－1，而朱砂在水中溶解度只有 0.001 g·L－1［4］。小鼠一次口服染毒朱砂20 g·kg－1(约相当于临床剂量的250倍)未见死亡，而染毒甲基汞(MeHg)0.1 g·kg－1或氯化汞0.15 g·kg－1则致死［11］。此外，体外实验亦表明，雄黄和朱砂的细胞毒性远小于亚砷酸钠、砷酸钠、氯化汞和甲基汞［11，18］。因此，砷和汞化合物的形式决定了其毒性。

由于国际上对砷和汞毒性的普遍关注，我国对《中国药典》中的雄黄和朱砂剂量进行过修订，如1990年版及以往的历版药典雄黄、朱砂日用剂量较大，为0.3～1.5 g，1995年版药典将雄黄和朱砂剂量降至0.1～0.5 g。然而这种剂量调整仅仅是出于对朱砂和雄黄毒性的担忧，并没有充分的科学依据［8］。含雄黄的牛黄解毒片复方对发热模型大鼠炎症介质有抑制作用［7］。在病理状态下(感染性脑水肿)安宫牛黄散可抑制被过度激活的乳酸脱氢酶［9］。还有研究表明，去除雄黄和朱砂的中药复方药效降低［12－15］，在脑出血大鼠模型，安宫牛黄丸全方(含雄黄和朱砂)可通过影响兴奋性氨基酸的表达明显降低脑组织的继发性损害，去除雄黄和朱砂的减方药作用不明显［12］。在改善脑出血大鼠的神经功能障碍、降低脑系数和脑血肿、周围脑组织含水量及提高红细胞变形能力方面，全方药也有优于减方药的趋势［13］。最近研究表明，雄黄是安宫牛黄丸抗炎作用的有效组分之一［14－15］。雄黄和朱砂在万胜化风丹中的确切药理作用还有待进一步研究。

剂量和用药时间是药物产生毒性的重要因素。虽然本研究表明万胜化风丹的急性毒性远低于其他砷汞化合物，但是选择药物的适应证依然很重要，因为不同病理状态对药物反应不一样，应合理用药，不要长期久服。比较长期服用朱砂安神丸［2］和安宫牛黄丸［10］的慢性毒性实验中发现，含雄黄和朱砂的中药复方毒性远远低于亚砷酸钠和氯化汞。

因此，用总砷、总汞来评价雄黄、朱砂的毒性缺乏科学可比性，应考虑其毒代动力学和毒理学特征。

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