选择性血浆分离器行双重血浆置换对抗中性粒细胞胞质抗体清除的研究

龚德华 季大玺 朱冬冬 徐 斌 崔 俊 刘志红

抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关血管炎(AAV)是一组血清ANCA阳性，临床表现为多系统小血管炎性损害的疾病。AAV常累及肺部及肾脏，肾脏损害多表现为急进性肾炎。在疾病的急性发作期，特别是危及患者生命的临床症状出现时，治疗的关键是快速诱导疾病的缓解，减轻及逆转脏器损害，方法包括大剂量甲泼尼龙联合免疫抑制剂治疗。尽管目前诊断技术及治疗方法不断改进，仍有相当部分患者由于严重并发症导致死亡，或出现终末期肾病(ESRD)，严重影响患者长期预后。国外资料显示5年内20%患者出现ESRD［1］，而国内资料则显示1年和3年肾存活率分别为66.8%和58.5%［2，3］。就诊时即有明显肾功能损害者预后更差，且对药物治疗反应不佳。目前发现的ANCA主要有两种类型，即针对中性粒细胞胞质嗜中性颗粒及单核细胞溶酶体髓过氧化物酶(MPO－ANCA)及针对蛋白酶 3(PR3－ANCA)的抗体。现认为ANCA在疾病的发病中起重要作用，且抗体滴度与疾病的活动度密切相关［4］。因此临床实践中也采用体外循环血液净化方法从循环中迅速清除致病性抗体，以期诱导疾病的缓解。血浆置换(PE)是一种常用的清除自身抗体的方法。其优点是简便易行，缺点是其清除非选择性，丢失大量有用血浆蛋白，需补充大量人体白蛋白或血浆［5］。在此基础上的改进方法为双重血浆置换(DFPP)，即先采用血浆分离器(一级滤器，膜孔0.2～0.5 μm)将血浆分离出来，血浆再经过血浆成分分离器(二级滤器，膜孔0.01～0.02 μm)滤过，分子量较小的血浆成分(主要为白蛋白及小分子蛋白)被二级滤器滤出后回输体内，而分子量较大的血浆成分(主要为免疫球蛋白，包含自身抗体)被截留而丢弃。DFPP由于相对选择性清除血浆大分子蛋白，减少了白蛋白的丢失及补充量，可增加单次治疗处理血浆量，有助提高致病性抗体的清除率［6］。虽然DFPP较PE清除蛋白的选择性增加，但同样存在大量有用蛋白丢失的问题，如非致病性免疫球蛋白及大分子凝血因子的丢失［7］。目前少有研究报道如何进一步提高DFPP清除蛋白的选择性，减少有用蛋白的丢失。本文提出一种新的DFPP方法，用于治疗AAV患者，即选择性血浆分离器行DFPP，观察对免疫球蛋白及ANCA的清除情况，并与原有DFPP方法，即采用普通血浆分离器与血浆成分分离器联合进行了对比，现报告如下。

对象和方法

研究对象 2010年4月至2011年4月南京军区南京总医院全军肾脏病研究所共对15例确诊为MPO－ANCA相关血管炎伴肾功能不全患者行DFPP治疗44次。患者男性9例，女性6例，平均年龄(53.9±15.6)岁(43～72岁)，临床均表现为急进性肾炎，治疗前平均血清肌酐(SCr)(433.16±88.4)μmol/L，肾外并发症3例(突发性耳聋1例，咯血2例)。药物治疗方案如下:甲泼尼龙0.5g，静脉滴注，连续3d，后予口服泼尼松30～45 mg/d维持，同时口服霉酚酸酯0.5 g/d，1例患者雷公藤多苷60 mg/d。患者在甲泼尼龙治疗结束后开始DFPP治疗。所有患者或其家属均签署知情同意书。

DFPP方法 均采用右侧颈内静脉留置双腔导管作血管通路，DFPP采用血液净化装置 IQ21(Asahi Kasei Kuraray Medical CO，Ltd，日本)进行，体外循环联接示意图见图1，采用低分子肝素联合枸橼酸抗凝，使活化凝血时间延长一倍以上。血流量设置为120～150 ml/min，一级滤器血浆分离流量为30～40 ml/min，二级滤器再循环流量为 60 ml/min。治疗步骤如下:(1)治疗开始时，一级滤器滤出血浆进入二级滤器再次滤过，滤出的血浆再经一微滤器后回输体内(微滤器起超滤脱水的作用)，被截留的血浆成分滞留在二级滤器中不断再循环，此时二级滤器后通往弃浆袋的三通呈关闭状态;(2)当二级滤器前压力逐步升高，超过150～160 mmHg时，将一级滤器后三通转向生理盐水通路，停止分离血浆，采用生理盐水800 ml冲二级滤器，使二级滤器中滞留血浆成分进一步滤过回输体内;(3)生理盐水冲滤器完毕后，将二级滤器后的三通转向弃浆袋，使二级滤器中仍残留的血浆成分进入弃浆袋丢弃。这一过程即为一个循环，结束后即将一级滤器后的三通转向血浆分离通路，继续分离血浆及处理血浆，开始下一治疗循环。处理血浆达2倍血浆容量时即结束治疗。整个过程中共补充人体白蛋白30～40g。意大利，面积0.68m2，最大孔径0.5 μm)作一级滤器，采用 EC50W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面积2.0m2，孔径0.03 μm)作二级滤器。有1例患者采用此种方法行DFPP 3次，因清除免疫球蛋白G(IgG)不理想，后续患者未再采用此方法。

图1 双重血浆滤过体外循环联接示意图

MPS07/EC20W组 采用MPS07作一级滤器，采用 EC20W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面积2.0m2，孔径0.01 μm)作二级滤器，有9例患者采用此种方法行DFPP 27次。

EC50W/EC20W组 采用EC50W作一级滤器，采用EC20W作二级滤器。最后5例患者采用此种方法行DFPP 14次。

标本采集 患者在每次治疗前后采血;每次治疗第一循环第一步骤结束时，同时从第1、第2、第3及第4采血点取标本;第二步骤结束时，同时从第3及第4采血点取标本;每次治疗结束时称取废弃血浆重量及留取废液标本。留取的标本检测血浆总蛋白、球蛋白、白蛋白及 IgA、IgG、IgM 水平及 MPOANCA滴度。MPO－ANCA采用ELISA方法检测，所用MPO购自SCIMEDX公司(美国)。

计算公式

滤器选择 本研究为非随机、前瞻性观察性研究，拟对比三种方法对免疫球蛋白及自身抗体的清除情况。根据患者所使用滤器，分为三组:

MPS07/EC50W组 采用MPS07(Bellco s.p.a，

单次治疗下降百分率(R)=(1－治疗后浓度/治疗前浓度)×100%

一级滤器筛选系数(SC)=采血点2浓度/采血点1浓度

二级滤器筛选系数(SC)=采用点3浓度/采血点4浓度

清除指数=(废液浓度×废液量)/(治疗前血液浓度×血浆容量)

白蛋白清除指数=(废液白蛋白浓度×废液量)/(治疗前血清白蛋白浓度×血浆容量+补充白蛋白量)

统计学方法 分析采用SPSS11.0统计软件包，结果采用均数±标准差表示。治疗前后浓度比较采用成对样本均数比较的student－t检验，P＜0.05有统计学差异。

结 果

15 例患者共接受44次DFPP治疗，治疗过程顺利，无一例患者出现治疗相关的严重不良反应。治疗结束后，2例咯血患者症状缓解，15例患者肾功能稳定，无需肾脏替代治疗，1例治疗前已开始肾脏替代治疗患者，肾功能未恢复，改为维持性透析治疗。所有患者血ANCA滴度显著下降。

三种滤器的筛选系数 MPS07为一级血浆分离器，能滤过绝大部分血浆白蛋白、IgA、IgG及IgM;EC50W为二级血浆成分分离器，但膜孔径相对较大，能滤过大部分白蛋白，部分 IgA、IgG及少量IgM;EC20W为膜孔径较小的二级血浆成分分离器，只能滤过部分白蛋白及IgG，少量IgA，及极少量IgM(图2)。

图2 血浆蛋白筛选系数

单次治疗血浆蛋白下降百分率 三种方法对白蛋白的清除相当，每次治疗补充30～40g人体白蛋白情况下，对血浆白蛋白影响不明显。MPS07/EC50W组合对IgM清除最突出，其次为IgA，而对IgG清除则相对较少;MPS07/EC20W组合对三种免疫球蛋白清除都很明显;EC50W/EC20W组合对IgA及IgG清除较明显，而对IgM则基本不清除(图3)。

图3 单次治疗血浆蛋白下降百分率

MPS07/EC20W与EC50W/EC20W组合对ANCA的清除 MPS07/EC20W及EC50W/EC20W两种组合单次治疗IgG下降率分别为(51.0±10.0)%及(43.5±13.8)%，而MPO－ANCA水平下降率分别为(31.1±14.0)%及(34.6±14.3)%(表1)。

EC50W/EC20W组合DFPP每一循环中生理盐水冲二级滤器前后对滤器中蛋白浓度的影响 当每一循环中二级滤器前压力达到150～160 mmHg时，测定二级滤器血浆白蛋白及IgG浓度显著升高，在采用生理盐水冲滤器后两者都显著下降，而白蛋白更明显(表2)。滤器中IgG/白蛋白浓度比在冲滤器后升高24.2%。

表1 采用不同血浆分离器行双重血浆置换对血浆蛋白的清除

表2 生理盐水冲洗前后二级滤器中蛋白浓度变化(n=5)

讨 论

采用体外循环血液净化方法清除体内致病性物质已在临床广泛用于治疗自身免疫性疾病，如重症肌无力，ANCA相关血管炎，抗GBM抗体介导肺肾综合征等。血液净化方法包括PE和免疫吸附等［8－10］。其中PE由于方法简单使用相对普遍。与PE相比，DFPP相对选择性清除血浆中分子量较大的致病物质，而分子量较小的白蛋白则被回收体内，减少有用物质的丢失及所需外源性蛋白的补充量，在临床使用也逐渐增多。

应用DFPP时，首先需选择滤器，通常是选择血浆分离器作一级滤器，将血液中所有血浆成分滤出，再选择血浆成分分离器作二级滤器，对一级滤过的血浆再次滤过，回收小分子蛋白(主要是白蛋白)，而不能滤过物质(主要是免疫球蛋白)则被丢弃。血浆成分分离器根据其膜孔径不同分为不同型号，本文测定了EC50W及EC20W两种滤器对不同蛋白的清除特性。结合这一特性，临床可根据欲清除致病物质的分子量大小选择不同二级滤器。选择MPS07/EC50W组合，最突出的是对IgM的清除，单次治疗下降率可达90%，而对IgG则影响较小，因此可用于一些分子量特别大的致病物质的清除，如华氏巨球蛋白血症的 IgM［11］，高脂血症中的脂蛋白［12，13］。日本较多报道用于丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的治疗，主要通过这种方法大量清除血液中的HCVRNA病毒颗粒，从而降低体内病毒负荷，提高患者对后续药物治疗的反应性［14－16］。Hanafusa 等［7］采用这种方法治疗，IgG下降率18.6% ～21.9%，而LDL下降率则达63.7% ～65.6%，与本文结果相同。而自身免疫性疾病的致病性抗体，如ANCA，多为IgG型，少有IgM及IgA型自身抗体，如部分抗心磷脂抗体及类风湿因子。因此针对IgG型自身抗体，采用MPS07/EC50W组合并不合适。第二种选择为MPS07/EC20W组合方式。从本文结果可知，这种方式对血浆中除白蛋白以外大分子蛋白清除都较显著，特别是IgM及IgA。而对于多数自身免疫性疾病患者而言，欲清除物质主要是IgG，采用这种方式治疗必然带来大量大分子蛋白的丢失，如IgM，IgA和一些大分子凝血物质。Tanabe［17］采用类似方式治疗患者在清除IgG达60%的同时，也清除70%的IgM。Hanafusa等［7］采用同样组合方式治疗可使患者血液中凝血因子Ⅷ活性严重降低。

为进一步提高清除物质的选择性，本文提出了EC50W/EC20W组合方式，即采用一个膜孔相对较大的血浆成分分离器作一级滤器，一个膜孔径相对较小的血浆成分分离器作二级滤器。EC50W作为一级滤器，只分离血液中欲清除的IgG，而不需清除的物质如IgM则不被分离，亦不被二级滤器所清除。因此采用这种方式治疗后，对IgM水平无明显影响。且每次治疗只需补充人体白蛋白30～40g(相当于血浆800～1 000 ml)，可使血浆IgG下降43.5%，MPO－ANCA滴度下降34.6%，对IgG的清除指数较白蛋白清除指数高1.6倍。虽然本文未测定对凝血因子的影响，但可推测与IgM分子量相当的物质可被大量保留，从而进一步减少有用物质的丢失，减少DFPP相关并发症。通过相关文献检索，本文所提出的这种组合方式还未见国内外其他作者报道。当然，采用这种方式单次治疗IgG下降率略低于传统方式［(43.5±13.8)%vs(51.0±10.0)%，P ＞0.05］，但奇怪的是ANCA水平的下降率则无明显差别［(34.6±14.3)%vs(31.1±14.0)%，P ＞0.05］。

目前临床所使用的DFPP方法一般采用两种弃浆方式，即连续式和间断式弃浆方式。前者即一级滤器分离出血浆以30～40 ml/min的速率进入二级滤器中被再次滤过，不能滤过的蛋白在二级滤器中被浓缩，浓缩液被以3～4 ml/min的速率连续丢弃;而间断式弃浆方式则不连续丢弃浓缩液，使之不断被浓集，二级滤器压力逐步升高，当压力达到一定程度，即用生理盐水将二级滤器中滞留的蛋白冲入弃浆袋中丢弃。我们发现，在废弃血浆中白蛋白浓度仍较高，如能将之再过滤，必可进一步减少白蛋白丢失。因此本文在采用间断弃浆方式基础上作了两点改进:一是增加了再循环泵，使二级滤器中的浓缩液不断再循环，不至于堵塞二级滤器导致效率降低;二是在二级滤器压力升高达到阈值后，并不直接弃浆，而是采用生理盐水将其再滤过后才弃浆。通过这种改进发现，可使二级滤器中白蛋白浓度降低42%，IgG降低28.2%，使滤器中IgG/白蛋白浓度比升高24.2%，即进一步减少了白蛋白的丢失。Jiang等［18］报道DFPP治疗顽固性荨麻疹，在补充20g人体白蛋白情况下，患者血浆白蛋白从35.4 g/L显著降至21.8 g/L。而Ramumni等报道的DFPP治疗单次IgG下降率仅为28.8%［19］。与这些报道结果相比，本文提出的改进DFPP方法在只需补充人体白蛋白30～40g情况下对血浆白蛋白无影响，且获得较好的IgG下降率及有效降低MPO－ANCA滴度。

本文还观察到IgG与ANCA水平下降不平行，即部分患者治疗前后IgG下降幅度很大，而ANCA水平则无明显下降。本文表1结果也显示，MPS07/EC20W组IgG下降率高于EC50W/EC20W组［(51.0±10.0)%vs(43.5±13.8)%，P ＞0.05］，但其 MPO－ANCA下降率反不如后者［(31.1±14.0)%vs(34.6±14.3)%，P ＞0.05］。造成这些现象的具体原因尚不清楚。在这部分患者弃去废血浆中亦检出大量ANCA被清除。我们推测可能与ANCA的体内分布有关:有的患者ANCA主要存在于循环中，因此血IgG与ANCA平行下降;而有的患者ANCA则可能大量沉积于组织，当血液中水平略有下降时，组织中ANCA即重新进入循环，导致循环中ANCA水平变化不明显。

小结:DFPP是一种能有效清除血液中致病性大分子物质的血液净化方法，且需补充蛋白量少，值得临床推广使用。临床应根据欲清除的致病性物质特性来选择不同一级滤器及二级滤器。针对血管炎致病性抗体MPO－ANCA，笔者提出以血浆成分分离器EC50W作一级滤器，EC20W作二级滤器的新组合方式，改进了原有的DFPP方法，同时证实进一步增加了DFPP清除物质的选择性，避免有用大分子物质丢失，但可能轻度降低IgG下降率。临床观察可有效降低患者血清MPO－ANCA滴度，但对患者临床症状及预后的影响还需扩大病例及进一步的研究观察。

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