玉米组氨酸三聚体核苷结合蛋白基因Zm-HINT 1的克隆及其原核表达载体构建

吴刘记，吴连成，祖小峰，王平安，陈彦惠

(河南农业大学农学院，河南郑州450002)

组氨酸三聚体核苷结合蛋白(Histidine triad nucleotide binding protein，HINT 1)是组氨酸三聚体蛋白超家族的成员，是一个具有核苷酸转移酶和水解酶活性的家族，晶体结构研究结果表明，HINT 1是其他4种组氨酸三聚体蛋白超家族成员的祖先，参与了重要的生物学功能.自从HINT 1首次在牛中被分离出来并被证明具有生物学功能后［1］，许多HINT 1的同源物也依次从兔、人中被克隆出来，并开展了相关研究，尤其是HINT在医学领域发挥着重要作用［2，3］.但是目前尚没有关于植物 HINT的功能研究，尤其是尚未见到关于玉米HINT的研究报道.玉米既是中国重要的经济作物，同时也是基础研究领域的模式物种［4］，为了进一步揭示植物HINT的功能，本研究以玉米作为研究载体，通过电子克隆方法和RT－PCR技术克隆了玉米黄早4 HINT 1基因的cDNA序列，并构建了其原核表达载体，为玉米HINT1理化性质及生理功能的研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

温带玉米自交系材料黄早4种子由国家玉米改良中心郑州分中心实验室保存，温室内培养，待长到4片叶时进行取样.

1.2 主要试剂及菌株

TRIzol试剂(invitrogen公司)，RT－PCR kit、T载体、DNA相对分子质量标准(DL 2000)均购自Takara公司，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen公司)，EcoRI和 XhoI限制性内切酶、T4连接酶(Takara公司)，PET－28a表达载体购自Novagen公司.

1.3 引物设计和合成

根据NCBI数据库Genbank中人和小鼠HINT 1基因比对，通过电子克隆的方法设计黄早4 HINT 1基因的cDNA全长序列扩增引物5’-ATTTATCGTT TATCCACGGA-3’和 5’-GAGCAGATCAGCAAGGC CA-3’进一步克隆测序，根据黄早4 HINT 1基因的编码框序列，设计带有酶切位点(EcoRI和XhoI限制性内切酶)的引物序列:5’-ACGAATTCATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3’和 5’-ACCTCGAG TTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3’，用于原核表达载体的构建.

1.4 总RNA的制备及cDNA的合成扩增

总RNA的制备按照TRIzol试剂的操作说明进行，然后利用制备的RNA，按照RT－PCR反转录试剂盒的操作说明进行cDNA的合成反应.

1.5 PCR产物连接与转化

将PCR产物经胶回收和纯化后，采用T－A克隆方法，和PMD－18T载体按一定比例连接过夜;然后将10 μL连接产物进行克隆转化.

1.6 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析

挑选阳性菌斑，接种于LB(Luria-Bertani)液体培养基，培养4 h后，吸取1 μL菌液作为模板进行PCR反应，并将阳性克隆送上海英俊公司进行测序.

1.7 原核表达载体的构建及鉴定

以黄早4 cDNA为模板扩增HINT 1编码区，PCR产物分别连入PMD－18T载体，进行克隆转化，挑选若干个克隆进行PCR鉴定及测序鉴定.同时将PCR阳性克隆产物进行EcoRI，XhoI限制性内切酶双酶切，连入经过同样双酶切的表达载体的相应位点上，转化大肠杆菌TGⅠ.PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得重组质粒PET－HINT 1.

2 结果与分析

2.1 黄早4 HINT 1基因的cDNA扩增

根据数据库中HINT 1基因的同源序列设计引物，以反转录后的cDNA为模板，PCR扩增黄早4 HINT 1基因的cDNA，结果如图1所示:PCR扩增出了1条大小约729 bp的片段，同时阴性对照(以蒸馏水作为PCR反应模板)没有条带，说明用于扩增的PCR引物有很好的特异性.

图1 PCR产物凝胶电泳分析Fig.1 1%agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 黄早4 HINT 1基因的序列分析

黄早4 HINT 1经克隆测序后所得的核苷酸序列如图2－A所示，编码的氨基酸序列如图2－B.其全长cDNA序列为729 bp，编码框为387 bp，编码129个氨基酸.5’和3’端分别包含1个66和276 bp的非编码区.Poly(A)信号位于 3’UTR 708～729 bp处.氨基酸序列分析结果表明，该蛋白的预测相对分子质量是14.23 kD，等电点是5.99.和其他物种HINT 1氨基酸序列比对分析发现，黄早4 HINT 1包含保守的活性位点区域，包括HIT基序，折叠区，这些保守的区域是HINT 1蛋白家族的重要特征.此蛋白和人HINT 1、小鼠HINT 1、鲍鱼 HINT 1比对的相似度分别为 61.6%，61.6%和45.7%(图3).

2.3 黄早4 HINT 1基因原核表达载体的构建

以黄早4 cDNA为模板，用加有酶切位点(EcoRI，XhoI限制性内切酶)的特异性引物进行PCR扩增，得到387 bp左右大小的特异性条带，与预期的产物大小一致(图 4).将 PCR产物经EcoRI，XhoI限制性内切酶酶切，同时，将PET－28a表达载体经相同的酶切(图5)，回收目的基因及载体酶切后片段，经连接酶16℃连接过夜，转化入感受态细胞中进行克隆分析.

2.4 黄早4 HINT 1基因原核表达重组质粒的鉴定

用PCR反应筛选菌斑，鉴定重组质粒阳性克隆，结果如图6所示.随意挑选的5个菌斑均呈阳性克隆，说明重组基因载体构建中的连接效率比较高.任意选取其中2个将阳性克隆进一步测序验证，结果如图7所示，2个测序结果完全一致且没有移码现象，可用于下一步的诱导表达，该重组质粒命名为PET－HINT 1.

3 讨论

图2 黄早4 HINT 1基因核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of HINT 1 of Huangzao 4

图3 黄早4 HINT 1与人、小鼠、鲍鱼HITN 1氨基酸序列对比Fig.3 Alignments of the Zm-HINT 1 amino acid sequences with that of Homo sapiens HINT 1，Rattus norvegicus HINT 1 and abalone HINT 1

研究表明，HINT 1在低等动物和高等动物中具有很高的结构和功能保守性，而结构和功能的保守性，预示了HINT 1在生物体内发挥着重要的生物学功能.后续的研究也陆续证明了HINT 1蛋白参与了物质代谢、转录调控、细胞生长、细胞凋亡等［5］重要的生物学进程.同时，目前有研究报道了关于哺乳动物HINT 1在肿瘤细胞凋亡、肿瘤发生、发展中发挥了重要作用［6］，虽然具体的功能机制尚不清楚，但是为其用于肿瘤治疗提供了一定的理论依据，将成为科学家进一步研究的热点.相对脊椎动物HINT 1的研究，对其他物种HINT 1的研究还比较缺乏，目前的报道也只是停留在利用基因组和蛋白质组的方法，得到相关基因序列.如LIU等［7］报道了日本血吸虫 Schistosoma japonicum的HINT 1 序 列，SWINGLEY 等［8］报道 了蓝藻 菌Acaryochloris marina的 HINT 1序列，在植物中，HINT 1的功能研究更有待于进一步探讨［9］.

图7 测序鉴定重组质粒Fig.7 Identification of recombinant plasmid by sequencing

本研究通过同源克隆的方法，获得了玉米黄早4 HINT 1的全长cDNA序列及相应编码的氨基酸序列.序列分析结果表明该基因全长cDNA为729 bp，包含了387 bp的编码框序列，编码129个氨基酸.氨基酸序列分析结果表明，该蛋白的预测分子量是14.23 kD，等电点是 5.99.与国家玉米改良中心郑州分中心实验室在热带玉米自交系材料CML 288中所克隆的HINT 1基因相比，基因序列完全一致，说明了HINT 1基因序列的保守性，也间接暗示了该基因在功能上的保守性.为了进一步探索研究玉米HINT 1基因的功能，作者构建了HINT 1的原核表达载体，该原核表达载体是大肠杆菌原核表达系统里最为常用的载体之一，具有能够在体外进行可溶性表达及表达量较高的特点.同时，利用该表达载体上带有6×Histag表达标签，使得表达出来的融合蛋白能够直接利用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化操作，也可以利用His单克隆抗体进行western blot免疫杂交反应，进而对表达的蛋白进行检测鉴定.总之，本研究克隆了玉米黄早4 HINT 1基因，同时构建了HINT 1的原核表达载体，为玉米HINT 1的功能研究奠定了基础.

［1］ PEARSON J D，DEWALD D B，MATHEWS W R，et al.Amino acid sequence and characterization of a protein inhibitor of protein kinase C ［J］.J Biol Chem，1990，265:4583－4591.

［2］ 关 杨.HINT 1基因对人黑素瘤细胞A375生物学行为影响的实验研究［D］.北京:北京协和医学院，2009.

［3］ 陈柳青，林 彤，曾学思，等.组氨酸三聚体核苷结合蛋白1mRNA在良恶性黑素细胞肿瘤中的表达［J］.中华皮肤科杂志，2006，39(3):134 －136.

［4］ BENNETZEN J L，HAKE S.Handbook of maize:genetics and genetics［M］.New York:Springer，2009.

［5］ KORSISAARI N，ROSSI D J，LUUKKO K，et al.The histidine triad protein hint is not required for murine development or Cdk 7 function［J］.Mol Cell Biol，2003，23:3929－3935.

［6］ WEISKE J，HUBER O.The histidine triad protein Hint1 triggers apoptosis independent of its enzymatic activity［J］.J Biol Chem，2006，281:27356－27366.

［7］ LIU F，LU J，HU W，et al.New perspectives on hostparasite interplay by comparative transcriptomic and proteomic analyses of Schistosoma japonicum［J］.PLoS Pathog，2006，2(4):268－281.

［8］ SWINGLEY W D，CHEN M，CHEUNG P C，et al.Niche adaptation and genome expansion in the chlorophylld-producing cyanobacterium Acaryochloris marina［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105:2005－2010.

［9］ 吴刘记.组氨酸三聚体核苷结合蛋白研究进展［J］.西北植物学报，2010，30(7):1499 －1505.