河南省番茄溃疡病的发现与分子确诊

李江利，欧阳林杰，郭淼淼，蒋士君

(河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002)

番茄细菌性溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)是一种典型的种传维管束病害，其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种.该病首次发现于1909年的美国，1943年至1946年间曾在英国严重流行［1～3］，目前已普遍发生于欧美多国.因该病害危害严重且极易通过种苗和流水等传播，中国等许多国家将其列为危险性检疫对象，但番茄溃疡病在田间或温室内的再侵染危害要明显轻于初侵染造成的损失［4～6］.中国番茄溃疡病的记载始于1954年俞大绂和方中达在大连市场上采集到的“鸟眼斑”番茄果实［7］.但此病目前已分布于北京、河北、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、山西、山东和上海等多个省(市)的保护地和露地番茄田.一般田块病株率在5% ～30%，重者高达70%以上，损失惨重［7］.作者于2009－03在郑州市中牟县白沙乡部分温棚番茄上发现了一批番茄溃疡病疑似病株，调查发现该病由带菌种苗传播所致，在大棚内适宜的温湿度条件下病害迅速蔓延.由于番茄溃疡病的高度危险性和极易传播性，带菌种子或种苗会造成严重的病害并使作物减产，因此开发快速、准确的检测技术对植物检疫和病害的田间诊断都具有重要的意义［8］.半选择性培养基、病害形态观察及生化测定等常规的鉴定比较繁琐，而PCR技术被认为是非常有用的能快速鉴定病害的分子生物学技术［9，10］.为准确鉴定此病害，并为迅速防治提供科学依据，作者在常规细菌学鉴定的基础上，重点探索了针对CMM的16-23S ITS和毒性基因的双靶点PCR联合鉴定技术，该技术对于快速、特异地检测植物检疫性番茄溃疡病原细菌和病害的快速确诊具有非常的意义.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 发病组织样品 采集郑州市中牟县白沙乡的大棚内发病番茄植株，采集的病株根、茎、叶及病株根围土壤用来分离培养细菌.

1.1.2 主要试剂和试剂盒 TaqDNA聚合酶、pMD19-T载体试剂盒和PCR凝胶纯化试剂盒均购自TaKaRa公司.

1.1.3 供试细菌菌株 番茄溃疡病菌标准菌株T30(河南省农科院惠赠)、大肠杆菌Jm109(河南农业大学分子植物病理学实验室保存).

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 对采集到的发病材料及病株根围土壤使用NA培养基进行常规分离和培养，置于27℃下培养2～3 d，根据菌落形态选择代表性细菌分离物.

1.2.2 常规细菌学鉴定 菌体染色采用赖夫生染色法，革兰氏反应采用质量分数为3%KOH水溶性法;氧化酶试验、明胶液化试验及过敏性与致病性测定参照方中达［11］的方法.

1.2.3 分子生物学鉴定

1.2.3.1 基于 CMM 16-23S rDNA ITS 的 PCR 鉴定 根据已公开的CMM的ITS基因序列的保守性，设计了特异性引物5’-GCATGTGCACCTCTC CTCTGTAT-3’(ITS1)和 5’-TCACATGAGATTGAATCGTTTCGCCT-3’(ITS2).以具有诱导烟草过敏性能力的细菌分离物基因组DNA为模板进行ITS PCR扩增鉴定.预期扩增产物为420 bp.反应体系(25 μL)包括2.5 mmol·L－1dNTP 1 μL，5 U·mL－1Taq 聚合酶 0.5 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，引物 20 μmol·L－1各 1 μL，模板 1 μL.反应条件:95℃ 5 min后;94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，25个循环;72℃ 8 min.4℃保存PCR产物用质量浓度为0.7%琼脂糖电泳检测.扩增后的ITS产物进行T/A克隆，测序由上海捷瑞生物有限公司完成，采用DNAStar分析软件对ITS基因序列比对.

1.2.3.2 基于CMM 毒性基因的PCR鉴定 合成DREIER等［12］报道的CMM毒性基因扩增引物5’-GCGAATAAGCCCATATCAA-3’(CMM5)/5’-CGTCAGGAGGTCGCCTAATA-3’(CMM6)，对有过敏性诱导能力的细菌分离物进行PCR鉴定，预期扩增产物为 614 bp.25 μL的反应体系.反应条件同1.2.3.1.

1.2.3.3 引物灵敏性测定 分别使用上述两对引物进行灵敏度检测，设6个模板菌落1×106～10 cfu，6个模板DNA梯度2 ng～20 fg，扩增体系及反应条件同上.8 μL PCR产物用质量分数为0.7%琼脂糖凝胶电泳检测.

2 结果与分析

2.1 番茄病害组织及根围土壤分离结果

通过分离共得到20个分离物，其中8个来自于茎秆，6个来自于叶片，4个来自于果实，2个来自于根围土壤.

2.2 病害分离物过敏性、致病性测定结果

20个分离物过敏性测定结果为有12个分离物有过敏性反应，将这12个分离物进行致病性测定(蘸根法)，J03，J07，J16，Y02，Y03，Y07，G01，G02和R01共9个分离物表现出叶片萎焉症状，将9个分离物接种至番茄幼果上(针刺法)，3～4 d后出现典型的“鸟眼斑”症状.而分离物Y05，G04与J08未表现出叶片萎焉及“鸟眼斑”症状.

2.3 生理生化测定结果

通过对12株有过敏性反应的分离物进行方法中列举的3项生理生化测定知上述有致病性反应的9个分离物形态与标准菌株一致，即为革兰氏阳性菌，氧化酶试验反应阴性，明胶液化能力较弱.

2.4 形态学鉴定

对分离物的菌落形态观察知上述9个分离物菌落呈圆形，表面有突起，边缘整齐，不透明，粘稠，颜色初为淡黄色，后变成明显的黄色，经菌体染色知这些分离物菌体分裂时呈“V”字形，这是番茄溃疡病菌分裂时特有的现象，与标准菌株一致，因此可以初步确定分离出的9个分离物为同一种致病菌，均为番茄溃疡病菌.

2.5 致病性分离物的双基因联合鉴定

根据番茄溃疡病菌保守序列设计引物的ITS1/ITS2及DREIER等［12］设计的扩增毒性基因的引物CMM5/CMM6，对有过敏性反应的12个菌株进行扩增，上述9个菌株均能扩增出420 bp与614 bp的目标片段，其余3个菌株则均无条带产生(图1).

图1 番茄溃疡病菌的ITS及毒性基因PCR检测.ITS1/ITS2(A)及CMM5/CMM6(B)Fig.1 ITS and toxic gene PCR analysis of Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis

2.6 灵敏度检测结果

利用不同含量的CMM(1×106～10 cfu)模板菌落和模板DNA(2 ng～20 fg)，对2对引物进行灵敏度检测，模板菌落最低均可检测到1×103cfu·mL－1.引物对 ITS1/ITS2最低可检测到2 pg模板DNA的目标菌，但引物对CMM5/CMM6灵敏性略低于引物对 ITS1/ITS2，只可检测到20 pg模板DNA的目标菌(图2).

图2 引物对灵敏性检测结果Fig.2 Determination of the sensitivity ITS1/ITS2(A)及CMM5/CMM6(B)

2.7 基于ITS序列的系统进化分析

ITS序列在进化过程中可以将突变保留下来，从而多态性更高，一般可以将微生物区分到亚种，因此对致病菌进行ITS序列系统进化分析.通过双基因鉴定知9种分离物为频繁出现的同一个致病菌株，因此对菌株J16的ITS序列PCR扩增后进行T/A克隆，测序后分析J16与GeneBank上已登录的11个同源物的系统进化关系(图3)，得知J16菌株属于CMM亚种，而与同种的其它4个亚种亲缘关系较远，但与同一个亚种内的已知菌株又有所区别.

图3 CMM菌株J16(ZM09J16ITS.seq)ITS序列及其11个同源物的系统进化关系图Fig.3 Phylogenetic tree of ITS gene of CMM and the homologens

3 结论与讨论

本试验经分离纯化共得到20个分离物，通过过敏性、致病性测定及基本的细菌学特性鉴定，得知有9个菌株理化性质及菌体形态与已报道的番茄溃疡病菌一致:有过敏性与致病性反应;革兰氏阳性;菌落形态米黄色、圆形凸起、边缘光滑、菌落粘稠、不透明;菌体分裂时呈“V”字形特征，由此初步确定此9个菌株为同一种病原菌，即为番茄溃疡病菌.

在此基础上进行分子生物学鉴定，根据番茄溃疡病菌的ITS序列设计引物及使用DREIER等［12］设计的扩增毒性基因的引物对有过敏性反应的菌株进行PCR扩增，9个分离物均扩增出与预期一致的420 bp与614 bp的产物，取菌株J16扩增出的ITS测序后与公开的CMM菌株的ITS序列进行系统进化分析，结果表明此菌株属于CMM亚种，而与CMN，CMS，CMT和 CMI等亚种的亲缘关系较远.因此，通过ITS及毒性基因的联合鉴定最终鉴明该致病菌确为番茄溃疡病菌.对两对引物进行灵敏性测定，模板菌落最低均可检测到1×103cfu·mL－1.引物对 ITS1/ITS2最低可检测到2 pg模板DNA的目标菌，但引物对CMM5/CMM6灵敏性略低于引物对 ITS1/ITS2，只可检测到20 pg模板DNA的目标菌.

PCR技术以其快速简便、灵敏度高、特异性强的优点，成为研究的热点，在各领域得到广泛应用和迅速发展，尤其对病害病原的鉴定是非常有用的，是现代病原鉴定常用的方法.DREIER等［12］利用番茄溃疡病菌携带的质粒为靶序列进行检测，但由于该质粒易突变，多态性强，不同菌株之间变异大，不能将所有菌株都鉴定出来.本实验对菌株J16进行质粒抽提后，检测得知并未提出毒性质粒，但是提取基因组后可以通过PCR检测到毒性基因，因此认为该质粒可能整合进基因组中.16S和23S间的ITS序列在不同属种中的拷贝数以及碱基序列都有不同，多态性更高，一般可以将微生物区分到亚种，因而是进行细菌种下分类鉴定的理想区域［13］.基于ITS基因序列设计的特异性引物ITS1/ITS2最低灵敏度可检测到1×103cfu模板菌落和2 pg模板DNA的目标菌，灵敏度高于付鹏等报道的最低可检测到1×105cfu菌体和50 pg模板DNA的目标菌的引物［14］.本试验使用番茄溃疡病菌的毒性基因及ITS序列的联合鉴定具有准确快速性，避免了毒性基因鉴定不能将所有菌株都鉴定出的缺陷，并通过ITS序列测定确定了病害所属的种，目前发现还未有此鉴定方法.

本试验经过一系列测定确定了番茄细菌性溃疡病的发生，该检疫性病害在河南的鉴定在以往文献中尚无报道，因此，这是河南省首次发现并确诊番茄细菌性溃疡病.研究结果将为病害的分子检测和溃疡病的防治提供重要依据，建议今后在生产中应加强番茄种苗的检疫检验，防止该病害的扩散蔓延.

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