银杏叶提取物对自发性高血压大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化的影响

崔晓雪，顾 晔

(华中科技大学 同济医学院 附属普爱医院 心内科，湖北 武汉 430034)

原发性高血压是引起动脉粥样硬化的常见原因，以往认为内膜损伤是动脉粥样硬化性病变的基础，外膜仅起支持、营养作用。但近年研究发现，对损伤反应活跃的细胞绝大多数存在于血管外膜，其中成纤维细胞的表型转化在高血压动脉粥样硬化中发挥重要的作用[1]。本研究观察银杏叶提取物(GBE)对自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)血管外膜成纤维细胞表型转化的影响，为临床防治动脉粥样硬化提供实验依据。

1 材料

GBE注射液(金纳多，每支5 mL，含 GBE 17.5 mg;批号:2007122721)，德国威玛舒培博士药厂;DMEM培养基，Gibco公司;胎牛血清，Costar公司;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、胰蛋白酶，Sigma公司;α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。

FACSVantageSE型流式细胞仪。

清洁级SHR，雄性，8周龄，体重(200±10)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK(沪)2007-0005。

2 方法

2.1 细胞培养及分组

SHR 6只，用大鼠尾动脉血压计测定大鼠尾动脉收缩压，血压均达到21.3 kPa以上。常规处死，取胸主动脉，去除血管周围组织，分离出血管外膜。剪成1 mm3组织块，平铺于25 mL培养瓶底，翻转使瓶底在上，向培养瓶内添加含有20% 胎牛血清的DMEM培养基3 mL，放入细胞培养箱贴壁4 h，之后小心翻转培养瓶使贴壁细胞浸于DMEM培养基中继续培养。每2 d换液一次。5～7 d后待细胞达80%融合时用含0.02%EDTA的胰酶消化传代，采用差速贴壁法纯化成纤维细胞，第4～6代细胞用于试验。细胞分为对照组，GBE 25，50，100 mg/L剂量组，每组均为6个样本，每瓶细胞培养体积3 mL。各组先给予终浓度为10－6mol/L的 AngⅡ刺激30 min，再分别换为含不同浓度GBE(终浓度分别为25，50和100 mg/L)的DMEM培养基共培养24 h。对照组仅加DMEM培养基。

2.2 GBE对细胞增殖的影响

以1×104个/孔的第4～6代成纤维细胞接种于96孔板中，加无血清 DMEM培养基100 μL，37℃孵育24 h，使细胞生长同步化后加入AngⅡ(10－6mol/L)刺激30 min，换不同浓度GBE(终浓度分别为25，50和100 mg/L)DMEM培养基，对照组仅加DMEM培养基。20 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，吸弃上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振荡混匀 10 min，用酶联免疫检测仪测定490 nm波长处的吸光度值。

2.3 RT-PCR法检测α-SMA mRNA

收集各组细胞，用Trizol试剂盒抽提总RNA，用M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA，行PCR扩增。扩增条件:95℃ 60 s预变性，95℃ 15 s、60℃ 60 s，共 40个循环。α-SMA引物序列:正义链 5'-GCAGGGGACAGAGGGACTTG-3';反义链 5'-GAGGCCATCGCTGCACTCA-3'。以GAPDH作内参照，经琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶图像处理系统分析。α-SMA mRNA表达水平用所测定的α-SMA扩增产物的电泳条带密度与GAPDH电泳条带密度的比值表示。

2.4 流式细胞术检测α-SMA

胰蛋白酶消化贴壁的成纤维细胞，4℃，75%乙醇溶液固定，流式细胞仪检测表达 α-SMA的XMode值，以反映单个成纤维细胞表达α-SMA的量，每份样品含5×105个细胞。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 血管外膜成纤维细胞培养

根据长出的细胞形态学和免疫学表型确定为成纤维细胞。倒置显微镜下观察，细胞有一个核或多个核，边界清楚，折光率较高，以梭形细胞为主，也有三角形、多角形细胞，连接成网(图1)。

图1 培养的第4代外膜成纤维细胞(400×)

3.2 GBE对细胞增殖的影响

在培养24 h时，MTT法，用酶联免疫检测仪测定在490 nm波长处的吸光度(A)值，GBE 25，50，100 mg/L剂量组的 A值分别为(0.843 ±0.110)，(0.824 ± 0.121)，(0.815 ± 0.091)，与对照组的(0.853 ±0.122)比较，均无显著差异(P ＞0.05)。

3.3 GBE对SHR血管外膜成纤维细胞表达 α-SMA的影响

结果见表1。25，50，100 mg/L组成纤维细胞表达α-SMA mRNA和α-SMA蛋白值均明显低于对照组(P＜0.05);随GBE浓度增高，各组细胞 α-SMA mRNA和单个细胞α-SMA表达值降低，组间比较差异有统计学意义。

表1 GBE对SHR血管外膜成纤维细胞表达α-SMA的影响(n=6，)

表1 GBE对SHR血管外膜成纤维细胞表达α-SMA的影响(n=6，)

与对照组比较:1P＜0.05，2P＜0.01;与25 mg/L时比较:3P＜0.05;与50 mg/L时比较:4P ＜0.05

组 别 浓度 α-SMA mRNA α-SMA(X-Mode)/(mg/L)对照组 － 1.74 ±0.16 425.42 ±19.73 GBE 组 25 1.36 ±0.121 358.26 ±12.551 50 0.82 ±0.071，3 316.41 ±10.121，3 100 0.61 ±0.052，4 276.59 ±11.832，4

4 讨论

血管主要由内膜的内皮细胞、中膜的平滑肌细胞、外膜的成纤维细胞以及细胞外基质组成。近年研究表明，外膜的成纤维细胞在高血压等刺激下表型转化为肌成纤维细胞(MF)，其标志性蛋白是α-SMA[2]，细胞进而发生增殖、迁移、分泌大量细胞外基质，参与血管新生内膜的形成[3]。

本研究观察了GBE对SHR血管外膜成纤维细胞表达α-SMA的影响，结果显示:①25～100 mg/L的GBE均能抑制血管外膜成纤维细胞表达α-SMA mRNA，且抑制作用呈浓度依赖性增强;②流式细胞仪检测单个成纤维细胞表达α-SMA的结果显示，25～100 mg/L GBE组的单个成纤维细胞表达α-SMA的均值均明显低于对照组，与浓度成反比，组间比较差异有统计学意义。提示GBE在基因水平和蛋白水平均显示出对血管外膜成纤维细胞表型转换的抑制作用。分析可能机制为:从银杏叶中提取的GBE是一种天然活性物质，其有效成分为黄酮苷及银杏内酯[4]，黄酮苷具有清除氧自由基，抑制脂质过氧化的作用，所以能部分中和MF合成分泌肿瘤坏死因子、一氧化氮等的炎性介质;银杏内酯是一种特异而有效的血小板活化因子受体拮抗剂，能抑制血小板聚集，防止血栓形成，且对血管内皮细胞有保护作用。总之，GBE能抑制原发性高血压大鼠血管外膜成纤维细胞的表型转化，对防止血管壁增厚和硬化有一定作用，其具体机制还有待进一步研究。

[1]李 莉，高平进，沈伟利，等.血管紧张素Ⅱ诱导自发性高血压大鼠血管外膜成纤维细胞迁移活性涉及P38MAPK[J].中华心血管病杂志，2005，33(6):557-560.

[2]Zhou H Y，Chen W D，Zhu D L，et al.The PDE1A-PKCalpha sig-naling pathway is involved in the upregulation of alpha-smooth muscle actin by TGF-beta1 in adventitial fibroblasts[J].J Vasc Res，2010，47(1):9-15.

[3]车在前，高平进，姬开达，等.重组结缔组织生长因子对大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22(12):2317-2321.

[4]李相军，王 丹，石 艳，等.银杏叶提取物对体外培养大鼠肾成纤维细胞作用的实验研究[J].中国实验诊断学，2010，14(1):45-47.