氯霉素-羟丙基-β-环糊精滴眼液抑菌实验研究

裴小捷，凌沛学，王凤山

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

氯霉素滴眼液是治疗敏感细菌引起的结膜炎、角膜炎、沙眼等外眼感染的首选药[1]。但氯霉素对温度具有较高的敏感性，温度升高易引起氯霉素水解生成氯霉素二醇物，从而造成本品含量减少、药效降低。为此将其制成环糊精包合物，改善药物的溶解度与稳定性[2]。本实验探讨了氯霉素-羟丙基-β-环糊精滴眼液与其他处方氯霉素滴眼液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌抑菌作用的差别。

1 材料

氯霉素-玻璃酸钠滴眼液(山东博士伦福瑞达制药有限公司);氯霉素滴眼液(沧州光明药业有限公司)。

金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希菌(ATCC 8099)(山东省疾病预防控制中心菌种室)。

2 方法

2.1 供试液的制备

取氯霉素 0.25 g，羟丙基-β-环糊精 6.0 g，配以辅料依地酸二钠、玻璃酸钠、苯扎溴铵、硼酸、硼砂，加注射用水至100 mL制成氯霉素-羟丙基-β-环糊精滴眼液。依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准，将3组滴眼液调整为每20 μL含药量为 30 μg。

2.2 细菌悬液的制备[3]

取金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希菌(ATCC 8099)分别接种于营养琼脂斜面，置36℃培养箱培养18 h后取出，吸取稀释液5 mL加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔后吸取菌悬液至另一无菌试管，反复吹打均匀[4]。然后将菌悬液按严格无菌操作程序进行 10－1，10－2，10－3……倍比稀释，每一稀释级接种2个平皿，分别吸取1.0 mL加入无菌平皿内，向每个平皿倾倒40～45℃的营养琼脂培养基15～20 mL，轻轻振摇使供试液与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，置于36℃培养箱内倒置培养24 h，计数，以菌落数50～100 cfu的平板为准，每个稀释级2个平板生长菌落数平均值作为结果，使菌悬液的含菌量为5×105～5×106cfu/mL。

2.3 试验菌的接种

制备好的菌悬液在15 min内使用，用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105～5×106cfu/mL试验菌悬液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多菌液，用拭子涂布整个营养琼脂培养基平板表面，每涂抹1次，将平板转动60°，涂布3次，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周，保证涂布均匀，置室温干燥5 min。

2.4 抑菌片的制备[3]

直径6 mm的滤纸片，经121℃ 20 min高压灭菌后，置120℃干燥2 h，备用。取处理好的滤纸片放入洁净平皿内，每个滤纸片滴加供试液20 μL(含药量为30 μg)为试验样片;阴性对照样片滴加生理盐水20 μL，置无菌室晾干后在有干燥剂的容器内低温(－10℃以下)保存，少量放4℃备用。

2.5 抑菌剂样片贴放

待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。每个染菌平板贴放3片，阴性对照(1片)放在平皿中心，共4片，纸片贴好后须在15 min内放36℃生化培养箱培养。18～24 h后读取结果，选均匀而完全无菌生长的抑菌环测量，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，这都不作为抑菌环的边缘。用数显游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)，并记录测量数据。每次实验每个供试液组分别作3个平板。

2.6 判定标准

根据NCCLS标准，对采集的数据进行分析，阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效[5]。

2.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包，行×列表的χ2检验，以P＜0.05表示差异有显著性意义。

3 结果

3.1 金黄色葡萄球菌为试验菌

3组滴眼液做抑菌环实验，每个滴眼液组重复实验90次，结果见表1。经χ2检验，各组间无显著差异(P ＞0.05)。

表1 3组滴眼液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用Tab.1 The bacteriostatic action of three different eye drops on Staphylococcus aureus

3.2 大肠埃希菌为试验菌

3组滴眼液做抑菌环实验，每个滴眼液组重复实验90次，结果见表2。经χ2检验，各组间无显著差异(P ＞0.05)。

表2 3组滴眼液对大肠埃希菌的抑菌作用Tab.2 The bacteriostatic action of three different eye drops on Escherichia coli

4 讨论

氯霉素滴眼液对热和光敏感。羟丙基-β-环糊精是一种安全、稳定的辅料，对热、碱和光稳定，与难容性药物包合后能增加药物溶解度[6]，对角膜刺激性小，适合作眼科药物增溶剂。目前在眼部给药中的应用已涉及依诺沙星、地塞米松、双氯芬酸钠等药物。

对氯霉素-羟丙基-β-环糊精滴眼液进行了稳定性考察，结果表明，羟丙基-β-环糊精作为稳定剂与氯霉素形成包合物，可以有效地保护氯霉素结构中的酰胺键，从而抑制氯霉素水解，降低二醇物生成。抑菌试验结果显示，经过羟丙基-β-环糊精包裹的氯霉素滴眼液无论是对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌还是对革兰阴性菌大肠埃希菌均有良好的抑菌效果，且与玻璃酸钠-氯霉素滴眼液和氯霉素滴眼液的抑菌能力相比无明显差异。加入羟丙基-β-环糊精可增加氯霉素滴眼液的稳定性且不影响其抑菌能力。

[1]凌沛学.眼科药物与制剂学[M].北京:中国轻工业出版社，2010:16-17，194-195.

[2]郭维儿.β-环糊精增强氯霉素滴眼液稳定性研究[J].西北药学杂志，1998，13(3):114.

[3]中华人民共和国卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].2002.

[4]王桂亭，宋艳艳，王志波，等.大蒜液体外抑菌作用的实验研究[J].预防医学论坛，2006，12(2):131-133.

[5]施光锋，翁心华，陈为欢，等.5种常用β内酰胺类抗生素的体外抗菌活性比较[J].上海医科大学学报，2000，27(1):61-62.

[6]刘恒平.伊曲康唑包合物的制备与研究[J].中国生化药物杂志，2008，29(3):182-185.