花色素苷诱导小鼠巨噬细胞一氧化氮生成及其机制

金丽琴，陈秀芳，吕建新，刘明达，陈柏坤，钱 松

(温州医学院 1.基础医学院生物化学教研室，2.生命科学学院，3.附属第一人民医院 第八院区，4.药学院，浙江 温州 325035)

花色素苷是一类溶于水，无毒性，广泛分布于植物界的多酚类黄酮化合物。有研究表明，花色素苷具有抗氧化[1-3]、抗炎、抗肿瘤[4-5]等活性，而有关其免疫调节活性的研究报道较少。本实验从黑米中提取花色素苷，以矢车菊素-3-葡萄糖苷单体(cyanidin 3-glucoside，C3G)为阳性对照，观察其诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO生成的作用，旨在探讨花色素苷的免疫调节活性及其作用机制。

1 材料

黑米，市售;C3G、脂多糖(LPS)、RPMI 1640培养基，Sigma公司;胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司;红细胞裂解液、CCK-8试剂、NO、一氧化氮合酶(NOS)检测试剂盒，江苏碧云天生物公司;Trizol reagent RNA提取试剂盒，Invitrogen公司;RTPCR试剂盒，宝生物(大连)有限公司;iNOS、β-actin引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。

健康ICR小鼠，雌性，体重20～25 g，由温州医学院实验动物中心提供，温医动字2005-0061。

2 方法

2.1 黑米花色素苷的制备

选取外被色深黑粳米，纤维素酶酶解黑米米粒的表层，用90%乙醇浸提并终止酶解反应，去除醇溶性杂质，0.1 mol/L HCl溶液-55% 乙醇(15∶85)浸提液浸提，重复2次，减压蒸馏，Amberlite XAD-7大孔吸附树脂吸附，80%乙醇洗脱，真空抽滤去杂;减压浓缩，经冷冻干燥得粉末状黑米花色素苷(black rice anthocyanin，BA)[6-7]。高效液相色谱法分析测得花色素苷纯度为37.69%。

2.2 小鼠脾细胞增殖实验

小鼠断颈处死后，无菌操作取出脾脏，剔除系膜并将其剪碎后，置于筛网中研磨制备单个脾细胞悬液。用红细胞裂解液溶解红细胞后，用RPMI 1640培养液清洗2次，然后悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。调整脾细胞浓度为1×107/mL，按50 μL/孔接种于96孔培养板。设对照组和实验组，对照组加入培养基50 μL，实验组用RPMI 1640完全培养基溶解的不同浓度的BA按50 μL/孔加入，使实验组的终浓度分别达25，50，100，200，400 μg/mL，同时设立 C3G(100 μg/mL)组。各组均设4个重复孔。于37℃，5%CO2培养箱培养48 h，加入CCK-8试剂10 μL后再孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(A)值。

2.3 小鼠巨噬细胞NOS活性和NO含量测定

小鼠断颈处死，用预冷的RPMI 1640液6 mL灌洗腹腔，收集灌洗液，经RPMI 1640液洗2次后，将腹腔渗出细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640液调节细胞浓度为1×106/mL，接种于96孔培养板，每孔细胞悬液100 μL，在37℃，5%CO2培养箱中孵育2 h，洗去未贴壁细胞，贴壁的为巨噬细胞。将纯化的巨噬细胞分为6组:对照组(加完全培养基1 mL)，BA 50，100，200 μg/mL 组，C3G(100 μg/mL)组，LPS(1 μg/mL)组;每组做4 个重复孔，于37℃，5%CO2培养箱培养48 h。收集上清液后洗尽培养液，加入NOS检测缓冲液100 μL，再加入检测反应液100 μL，轻轻混匀，37℃细胞培养箱内孵育30 min，用荧光酶标仪检测 NOS活性(激发波长495 nm，发射波长515 nm)。上清液中NO含量采用硝酸盐还原酶法测定(按试剂盒说明书操作)。

2.4 巨噬细胞iNOS mRNA表达水平检测

按2.3项下方法分离、培养小鼠巨噬细胞，分成4组:对照组(加完全培养基 1 mL)、BA(200 μg/mL)组、C3G(100 μg/mL)组、LPS(1 μg/mL)组，每组做4个重复孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。用Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆转录试剂盒说明，采用随机引物逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，根据Genebank资料，以 iNOS、β-actin mRNA为模板，用软件 Primer 5.0设计引物，进行PCR扩增。iNOS，上游引物:5'-ACGCTCGGAACTGTAGCACA-3'，下游引物:5'-GCACATCAAAGCGGCCA-3'，扩增产物长度 276 bp;βactin，上游引物:5'-CCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游引物:5'-AGAAGGAAGGCTGGAAAA-3'，扩增产物长度459 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统分析处理。

2.5 统计分析

3 结果

3.1 BA对小鼠脾细胞增殖活性的影响

脾细胞在不同浓度BA的刺激下，均有不同程度的增殖，增殖活性随BA用量的增加而增加。与对照组比较，BA 50，100，200，400 μg/mL 组能明显促进小鼠脾细胞的增殖活性(P＜0.01)，而且有一定程度的剂量依赖效应;C3G组(100 μg/mL)促进小鼠脾细胞增殖的活性明显强于BA各组(P＜0.01)，见表1。

表1 BA对小鼠脾细胞增殖的影响(n=4，)Tab.1 Effect of BA on the proliferation of splenocytes in mice(n=4，)

表1 BA对小鼠脾细胞增殖的影响(n=4，)Tab.1 Effect of BA on the proliferation of splenocytes in mice(n=4，)

与对照组比较:1P＜0.01;与BA组比较:2P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group;2P ＜0.01 vs BA group

组 别 浓度/(μg/mL)A对照组 －0.255 ±0.021 BA 组 25 0.275 ±0.01350 0.416 ±0.0241 100 0.505 ±0.0651 200 0.648 ±0.0511 400 0.711 ±0.0471 C3G 组 100 0.953 ±0.0121，2

3.2 BA对小鼠巨噬细胞NO含量和NOS活性的影响

小鼠巨噬细胞NO含量，不同浓度BA组、C3G组和 LPS组显著高于对照组(P＜0.05或 P＜0.01)，C3G 组、LPS 组显著高于 BA 200 μg/mL 组(P ＜0.01)，见表2。

BA 100，200 μg/mL 组、C3G 组、LPS 组巨噬细胞NOS活性均明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，见表2。

表2 BA对小鼠巨噬细胞NO含量和NOS活性的影响(n=4，)Tab.2 Effect of BA on the NO synthesis and the NOS activity of macrophages in mice(n=4，))

表2 BA对小鼠巨噬细胞NO含量和NOS活性的影响(n=4，)Tab.2 Effect of BA on the NO synthesis and the NOS activity of macrophages in mice(n=4，))

与对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01;与 200 μg/mL BA 组比较:3P ＜0.011P ＜0.05，2P ＜ 0.01 vs control group;3P ＜ 0.01 vs 200 μg/mL BA group

组 别 浓度A相对荧光强度/(μg/mL)540nm对照组 － 2.578 ±0.063 615.5 ±46.6 BA 组 50 2.825 ±0.1861 632.5 ±25.9100 2.908 ±0.1672 750.5 ±77.41 200 2.963 ±0.2062 739.5 ±88.71 C3G 组 100 3.373 ±0.1072，3 836.0 ±108.62 LPS 组 1 3.555 ±0.1092，3 802.8 ±61.82

3.3 BA对小鼠巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响

与对照组比较，巨噬细胞iNOS mRNA在C3G组、LPS组都有较强表达，而BA组无明显表达，见图1。

图1 BA对小鼠巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响Fig.1 Effect of BA on the iNOS mRNA expression ofmacrophage in mice

4 讨论

NO由NOS催化L-精氨酸和分子氧反应生成。NOS是NO合成的限速酶，有3种亚型，内皮型NOS(eNOS)、神经元型NOS(nNOS)和诱导型NOS(iNOS)。iNOS是NO生成的主要限速酶[8]，生理情况下活性低，在 LPS、TNF-α、IFN-γ 等的诱导作用下活性增加，而iNOS活性的变化直接调控NO的产量及其生物学效应。巨噬细胞作为机体免疫系统的重要组成成分，在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用[9]。NO合成是巨噬细胞激活的重要标志，NO作为巨噬细胞重要的效应分子能增强巨噬细胞的溶菌和吞噬活性[10]。本实验显示花色素苷(包括BA和C3G)能够使巨噬细胞NO的生成增加，进一步观察发现花色素苷可以增加巨噬细胞NOS的活性。本实验同时也发现花色素苷能够促进脾细胞的增殖，使脾细胞活化。而脾细胞主要由T、B淋巴细胞组成，活化的 T、B 淋巴细胞能产生 TNF-α、IFN-γ、IL-2等多种细胞因子，增强机体的免疫反应。总之，花色素苷能够诱导小鼠巨噬细胞NO的合成，使巨噬细胞激活，同时促进脾细胞的增殖，表明花色素苷对机体具有一定的免疫调节活性。

本实验发现花色素苷的单体C3G作用优于BA，提示C3G是花色素苷中非常重要的活性成分。本实验同时也发现C3G可以诱导巨噬细胞iNOS mRNA的表达，表明C3G调节NO的合成主要发生在转录水平;而BA对巨噬细胞iNOS mRNA的表达无明显影响，可能与BA中花色素苷的纯度太低或其他成分影响其表达有关。

至于花色素苷促进小鼠巨噬细胞合成NO增加是否通过诱导巨噬细胞iNOS mRNA的表达来实现，以及其作用靶点、途径如何还有待进一步研究。

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