混菌发酵苹果渣生产饲料蛋白的研究

谢亚萍，张宗舟，蔺海明

（甘肃农业大学农学院，兰州 730070）

我国是世界最大的苹果生产国，2004—2007年中国苹果产量和栽培面积均居世界首位。随着人们生活水平的提高和观念的改变，所产苹果约20%用于生产果汁，榨汁后残留果渣的重量约为鲜果的25%～35%，如按此计算，我国年产苹果渣可达120～150万t。目前，我国仅有25%～30%的苹果渣用于肥料、燃料、饲料或其他用途，绝大部分因无法进行综合利用而废弃，几天内就腐烂变质，发出酸臭味，造成了严重的资源浪费和环境污染[1－6]。苹果渣中蛋白质含量低，但会有大量的果胶质、纤维素、半纤维素、维生素和矿物元素等成分[7－10]。但通过太空诱变获得的微生物发酵作用可以提高苹果渣中蛋白质含量，降低纤维素、半纤维素和果胶的含量。将苹果渣转化为营养丰富的蛋白质饲料，是对苹果渣有效利用的重要途径之一，对缓解我国蛋白饲料资源缺乏、提高苹果种植与加工效益、减少环境污染具有重要意义[11]。

本研究利用太空诱变获得的优良菌种黑曲霉ZM－8和白地霉以及酿酒酵母、热带假丝酵母复配制成混合菌剂，通过微生物固态发酵工艺，将果汁生产后产生的苹果渣转化为蛋白饲料，提高了苹果渣的蛋白质含量及营养价值，既能解决水果榨汁企业面临的现实问题，减少环境污染，又充分利用了资源，为缓解蛋白饲料短缺开辟了一条新途径，具有重要的经济效益和社会效益以及环境生态效益[12－15]。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

黑曲霉突变株ZM－8（Asp.niger ZM－8）保存于PDA斜面培养基[16]。该菌株是由经过太空诱变的菌株筛选而得，由本试验课题组提供。白地霉（Geotrichum candidum）保存于PDA斜面培养基，由天水师范学院微生物院实验室提供。酿酒酵母（Sac.cerevisiae）和热带假丝酵母（Candida tropicalis）保存于斜面麦芽汁琼脂培养基，由天水师范学院微生物实验室提供[17]。

1.2 试验材料

苹果渣由礼县果汁厂提供，麸皮、尿素等为市售。

1.3 培养基

麦麸培养基：将麸皮和水按1:1混合均匀后，装入250mL的三角瓶，每瓶装50 g；麦芽汁琼脂培养基；PDA培养基；固态发酵培养基：干苹果渣70 g、麸皮30 g、加自来水110 g混合、拌匀，再加硫铵、白糖、尿素、食盐。

培养基均在1.0×105Pa，121℃ 灭菌30min，自然pH。

1.4 发酵工艺

1.5 试验方法

以苹果渣70 g、麦麸30 g，并加水110 g，拌匀。将原料放置蒸煮锅中蒸30min，并依次加入硫铵、白糖、尿素和食盐等营养物质。

将三角瓶麸皮培养基固体扩大得到的太空诱变菌种黑曲霉ZM－8和白地霉以及用麦芽汁液体摇瓶培养基培养得到的热带假丝酵母、酿酒酵母按照不同比例混合制成太空复合菌剂。再将制成的太空复合菌剂于30℃下接种到蒸煮好的原料中，拌匀。

接种含有太空诱变复合菌剂之后，堆制24 h（堆温不要超过36℃），期间不断搅拌，24 h后原料上长满菌丝体，颜色为灰白色。将原料移入发酵池中，通风培养（温度不要超过36℃），48 h后培养结束。

将培养好的半成品从发酵池中移出，运进烘干室进行烘干。烘干温度为100℃，时间控制在3 h以内，水分控制在5%～7%为宜。烘干后降温、粉碎，进行质检。

1.6 测定指标

粗蛋白的测定采用GB/T 6434－94凯氏定氮法。

1.7 发酵条件的研究

1.7.1 培养基配方中各营养元素含量的确定

在单因素试验的基础上，以培养基中各营养成分硫铵、白糖、尿素、食盐为考察因素，采用L9（34）设计方案，因素水平见表1。自然pH发酵，低温烘干后测定粗蛋白[11]。

表1 试验因素水平g

1.7.2 多菌复配适宜配比的确定

在单因素试验的基础上，以培养基中黑曲霉ZM－8、酿酒酵母、白地霉和热带假丝酵母为考察因素，选用4因素3水平L9（34）正交表，设计正交试验，在自然pH发酵，低温烘干后分析粗蛋白含量，见表2。

表2 试验因素水平g

1.8 数据处理

利用DPS软件对测定的数据进行4因素3水平正交试验极差分析。

2 结果分析

2.1 不同培养基配方对产物中粗蛋白含量的影响

不同培养基配方对产物中粗蛋白含量的影响见表3。

表3 优化发酵条件的L9（34）正交试验结果

由表3可知，尿素对发酵产物中粗蛋白含量的影响最大，其次是硫铵，再是食盐，最后是白糖；最优水平组合为：C2A2D2B1，即硫铵7 g、白糖4 g、尿素2 g、食盐4 g，在确定的优化条件下发酵苹果渣，产物中粗蛋白含量可达26.4%。

2.2 多菌复配不同配比对产物中粗蛋白含量的影响

多菌复配不同配比对产物中粗蛋白含量的影响见表4。

由表4可知，黑曲霉突变株ZM－8对发酵产物中粗蛋白含量的影响最大，其次是热带假丝酵母，再是白地霉，最后是酿酒酵母；最优水平组合为A1D3C2B3，即黑曲霉突变株ZM－8 0.5 g、酿酒酵母1.5 g、白地霉1.0 g、热带假丝酵母1.5 g，在确定的较优条件下发酵苹果渣，产物中粗蛋白含量可达27.9%。

表4 苹果渣发酵生产菌体蛋白的L9（34）正交试验结果

3 讨 论

由正交试验结果可知，蛋白质含量明显提高。菌体蛋白饲料中的粗蛋白可能来自3个方面：菌种本身含有的蛋白质、发酵基础物中存在的蛋白质以及转化而来的蛋白质。用混菌发酵是利用各菌之间的协同作用，提高发酵效益，产品有较强的果香味和酒香。任克宁等采用粪链球菌和啤酒酵母混合菌种发酵生产苹果渣生物饲料，结果表明，最佳工艺条件为发酵温度28℃，混菌菌株接种比例1∶1.2，发酵时间5 d，其发酵产品中真蛋白含量为13.51%，活酵母菌数23.27亿个·g－1，产品有芳香气味，适口性较发酵前有较大改观，具有蛋白饲料和微生态制剂的双重特性[18]。试验中各因素对粗蛋白含量的影响各不相同，但从生产成本和饲料的安全性出发，本试验的优化条件是可行的。由于研究条件的限制，对发酵后的果渣蛋白饲料未做动物饲养试验，其营养成分的可消化率无法详细测定。

4 结 论

通过正交试验获得了苹果渣发酵的适宜的培养基配方，即硫铵7 g、白糖4 g、尿素2 g、食盐4 g、可使产物中粗蛋白的含量达26.4%。利用太空诱变获得的优良菌种黑曲霉ZM－8和白地霉以及酿酒酵母、热带假丝酵母复配制成的混合菌剂，用于苹果渣的发酵，可以获得蛋白质含量较高的菌体蛋白，粗蛋白含量提高了335.94%。混合菌剂的最优配比为黑曲霉突变株ZM－8 0.5 g、酿酒酵母1.5 g、白地霉1.0 g、热带假丝酵母1.5 g。

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