航天诱变菌株黑曲霉ZM-8降解小麦秸秆产纤维素酶条件的优化

天水师范学院生命科学与化学院 马旭光 张宗舟

利用微生物酶解法预处理纤维素资源与传统的物理处理法、化学处理法相比，具有节约能源、反应条件温和、副产物少或无副产物、无环境污染等优点。微生物产生的纤维素酶对纤维素的降解是一个复杂的生物化学过程，受原料成分、培养温度、培养pH值、培养时间等众多因素的影响（蒋芳等，2006；徐昶等，2005；王景林等，2000）。因此，在具有性价比较高的纤维素酶产生菌株的基础上，优化其分泌纤维素酶的各种条件就显得至关重要。

本试验在前期已确定影响黑曲霉ZM-8在小麦秸秆为主要原料产纤维素酶的单因素研究基础上（马旭光等，2008），应用正交试验对各单因素进行优化，以期为提高农作物秸秆的利用效率、拓宽其饲用范围提供可靠的工艺参数。

1 试验材料

1.1 菌种 航天诱变黑曲霉 （Aspergillus niger）突变株ZM-8（马旭光等，2007），保存于PDA斜面培养基。

1.2 发酵主要原料 小麦秸秆粉 （过40目筛），麸皮（市售）。

1.3 试剂及仪器

1.3.1 主要试剂 DNS试剂，柠檬酸缓冲液，水杨素（Sigma），羧甲基纤维素钠，新华定性滤纸，其他均为国产的化学纯或分析纯。

1.3.2 主要仪器 恒温培养箱；高速冷冻离心机；722型分光光度计；恒温水浴锅等。

1.4 培养基

1.4.1 种子培养基 小麦秸秆粉10 g，营养液[（2% （NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25 mL。

1.4.2 固体产酶培养基 小麦秸秆粉6g，麸皮4g，营养液[（2.0%（NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25mL。

上述培养基均需在 1.0×105Pa，121℃灭菌30 min，pH 值自然。

2 试验方法

2.1 产酶培养基组分的优化 在前期单因素研究中发现，发酵培养中的麸皮添加量、氮源、含氮量以及水料比等都会不同程度地影响酶活力 （马旭光等，2008）。 本试验采用 L16（44）正交试验设计的方法对产酶培养基组分优化，试验因素水平见表1。

表1 产酶培养基正交试验因素水平

2.2 产酶培养条件的优化 前期的单因素研究表明，培养时间、温度、初始pH值和接种量都会对酶活有不同的影响（马旭光等，2008）。本试验均采用L16（44）正交试验设计方法进行发酵环境条件的优化，试验因素水平表见表2。

表2 产酶培养条件正交试验因素水平

2.3 复证 在已确定的最佳培养基组分和培养条件下测定酶活，并与在未优化培养基上的酶活力进行比较，以验证优化效果。

3 测定方法

3.1 发酵方法 将黑曲霉ZM-8的斜面孢子用无菌生理盐水洗脱，制成孢子悬浮液 （106～107个/mL），按10%（V/m）的接种量接入种子培养基中，28℃恒温培养72 h，待菌丝生长旺盛、孢子丛生时即可放入冰箱保存，供种曲备用。然后将制备的种曲按一定比例接入固体产酶培养基进行培养，28℃恒温培养72 h后取样测定酶活。

3.2 粗酶液的制备 取生长良好的固体发酵曲5 g，加水 50 mL，于 30℃保温 1 h，用沙芯漏斗过滤，然后在转速10000 r/min冷冻离心机上离心10 min，提取上清液定容至 100 mL，得 1∶20粗酶液。

3.3 酶活力的测定

3.3.1 FPU酶（滤纸酶）活力的测定 取适当稀释的酶液0.5 mL，加入50 mg滤纸条 （约1 cm×6 cm）和1.5 mL 0.05 mol/L的缓冲液，并向对照试管中加入1.5 mLDNS溶液以钝化酶活性，然后在50℃保温1 h，取出后立即向待测试管中加入1.5 mLDNS溶液以中止酶反应，充分摇匀后沸水浴5 min，冷却后在540 nm的波长下测定其光密度值。

3.3.2 CMC酶（内切酶）活力的测定 加入的底物为1.5 mL 0.51%CMC缓冲液，在50℃水浴中保温0.5 h，其余操作同3.3.1。

3.3.3 纤维素酶活力单位定义 在50℃，pH 4.8，恒温30 min条件下以水解反应中每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）（邬敏辰等，1997）。 计算公式为：

式中：5.56为1 mg葡萄糖的μmol数（1000/180=5.56）。

样品重为发酵后的固体干曲重量。

3.3.4 数据分析及处理方法 参考李春喜等（2000）对正交试验所得数据利用DPS软件进行极差分析。

4 结果与分析

4.1 产酶培养基组分的优化结果 结果见表3。

由表3可知，各因素对FPU酶活力的影响大小顺序为 A（含氮量）、B（氮源）、D（麸皮加入量）、C（加水量）。其最佳的产酶培养基组成为A3B2D2C2，即含氮量1.0%、氮源为碳酸铵、小麦秸秆与麸皮之比4∶1、料水比为1∶2。 对CMC酶活力的影响大小顺序为 B（氮源）、C（加水量）、A（含氮量）、D（麸皮加入量）。其最佳的产酶培养基成分为：B2C2A4D2，即：氮源为碳酸铵，料水比为 1∶2，含氮量为1.4%，小麦秸秆粉与麸皮之比4∶1。

表3 产酶培养基组分的正交试验极差分析

FPU是表征纤维素酶系中各组分酶之间的协同作用（徐昶等，2005），而CMC酶活代表外切β-1，4葡聚糖酶活力和内切酶活力的总和 （孔健，2005），再根据各因素对纤维素酶的影响大小，最终将产酶培养基确定为：氮源为碳酸铵、料水比为1∶2、含氮量 1.4%、秸秆粉与麸皮之比为 4∶1。

4.2 产酶培养条件的优化结果 结果见表4。

由表4可知，其FPU酶较佳产酶条件为A3B3D1C4，即：培养温度为 32 ℃，pH 值为 6.5，接种量为4%，培养时间为96 h。CMC酶的较佳产酶条件为A2C3B3D1，即：培养温度为28℃，pH值为6.5，接种量为4%。培养时间为72 h，培养温度和培养时间是影响CMC产酶的主要因素；培养温度对FPU的影响大于pH值和培养时间，其极差小于CMC酶；培养时间对FPU的影响较大，其极差远大于CMC酶；pH值和接种量对两种酶活的影响都不明显。综合上述分析，可将黑曲霉产酶的最佳条件确定为：C4A2B3D1。

表4 产酶培养条件的正交试验极差分析

4.3 复证 在已确定的最佳培养基组分和培养条件下测定酶活，即培养基配方：氮源为碳酸铵，含氮量1.4%、料水比为1∶2、小麦秸秆粉与麸皮之比为4∶1；培养条件：培养温度为28℃、培养时间为96 h、初始pH值为6.5、接种量为4%。测定结果表明：FPU和CMC的酶活分别为6.57 U/g和22.38 U/g。

5 小结

5.1 含氮量和加水量是影响产酶的最主要因素，其产酶培养基组分的最优组合为：最佳氮源为碳酸铵，含氮量1.4%，料水比为1∶2，小麦秸秆粉与麸皮之比为 4∶1。

5.2 培养时间和培养温度是影响产酶的最主要环境因子，其产酶的最佳培养条件为：培养温度为28℃，培养时间为 96 h，pH值为6.5，接种量4%。

5.3 在优化的培养基配方和培养条件下，其FPU和CMC的酶活分别为6.57 U/g和22.38 U/g。

[1]蒋芳，增林子，张强，等.饲用细菌纤维素酶的发酵条件优化与性质研究[J].中国饲料，2006，6：6 ～ 9.

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