饲料中四环素类抗生素的放射免疫分析

成都市产品质量监督检验院 周 浩 李俊霞 杨 红 肖全伟

四环素类是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，主要包括四环素、土霉素、金霉素等，由于具备抗菌谱广以及价格低廉等优点，已被广泛应用于畜禽、水生动物和蜜蜂养殖中（贾久满等，2007）。四环素类抗生素对于呼吸道和消化道疾病有很好的预防作用，促进生长作用效果较好，但容易被消化道吸收而残留在畜禽产品中，因此会严重危及人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏、肾脏的损害以及对牙齿和骨骼的破坏，最显著的残留毒性是诱导耐药菌株的产生（李俊所等，2002）。目前四环素类抗生素的检测方法有微生物法、酶联免疫方法、高效液相色谱法和质谱联用法 （闫小峰，2010；杜红鸽等，2008；王晶等，2002）等，虽然这些方法都准确可靠，但成本昂贵，前处理繁琐复杂，检测时间较长，无法缩短阴性样品的检测时间，远不能满足大批量样品快速检测的需要；放射免疫法结合了微生物法的准确与免疫法的高效，可用来快速筛选饲料中四环素族药物残留。本实验旨在建立一种可靠、特异性强的放射免疫法用于饲料中四环素类抗生素的日常检测。

1 材料与方法

1.1 设备与材料

1.1.1 仪器和设备 Charm II 7600分析仪，涡旋振荡器，电热恒温器，专用硼硅玻璃试管及试管塞，精密pH试纸（5.0～10.0），离心机，微量移液器等。

1.1.2 试剂 四环素类抗生素检测试剂盒及闪烁液，提取缓冲溶液，多抗标准品，缓冲液M2、阴性组织提取物，以上试剂均由Charm公司试剂盒提供。

四环素类药物标准品：四环素、土霉素、金霉素、氯霉素、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、红霉素、青霉素G等标准品，以上标准品均购于Sigma公司。

1.1.3 试验样品 市场购买饲料20组，四环素类抗生素留检阳性样品10组及阴性样品40组。

1.2 方法

1.2.1 测试原理 放射免疫原理基于两个方面，其一：每类抗生素族均是在一个母环基础上用不同的功能团修饰形成特定功效的抗生素。其二：微生物细胞表面都存在着能与抗生素功能基团结合的特异受体（王晶等，2002）。因此该法测定的基础是竞争性受体免疫反应，使用两种试剂:一种是被[3H］标记的四环素，另一种是四环素药物结合试剂（微生物细胞上的特异性受体）。当样品中含有四环素类抗生素残留时，残留物与结合试剂受体上的结合位点结合，从而阻止了[3H］标记的四环素与结合位点的结合。[3H］标记的四环素结合越多，则样品中四环素类抗生素残留越少。用液体闪烁计数仪测定样品中的[3H］的（每分钟脉冲数）[cpm]值，cpm值越大，样品中的四环素类抗生素残留量越低（陆勤等，2007；郑晶等，2005）。

1.2.2 样品处理 称取1 g饲料于带盖样品管，做好标记；加10 mL MSU提取缓冲液至样品管中，旋涡振荡15 s。用pH试纸测试pH值，滴加M2缓冲液，直到将pH值调至7.5，此液为待测液。

1.2.3 测定步骤 取出检测试剂盒，用压杆将白色药片（微生物受体）推出到空的试管中；用加液器取300 μL温水至管中，用旋涡振荡混合10 s将药片打碎；用移液器加5 mL样品，接着将橙色药片（[3H］标记的四环素抗体）推至试管中；用混合器混合15 s；在36℃的孵育器孵育5 min；将离心机调至4000 r/min离心5 min；立即小心弃去上清液，将测试管边缘的水珠擦干；加300 μL温水，用旋涡振荡混合10 s将沉淀物打碎；加3 mL闪烁液至试管中，加盖，混匀，静置1 min。在CharmⅡ7600分析仪的[3H］频道进行60 s计数，将测得结果与控制点比较，如果样品cpm值大于控制点，则判为阴性；如果样品cpm值小于或等于控制点，应判定为初筛阳性。

1.2.4 控制点的确定 首先用LC-MS方法确定6组饲料中四环素类残留阴性样品，选阴性样品加标浓度为50 μg/kg作为控制点。在6份阴性样品中分别加入标准溶液，形成样品中四环素类含量50 μg/kg，用1.2.2方法进行提取后，按照1.2.3的步骤进行测定，得出6个cpm值，计算其平均值。考虑提取过程中的回收以及防止假阴性出现，因此控制点的cpm值确定在平均值的基础上上调15%，即控制点cpm 值＝平均值×（1＋15%）。

1.2.5 阳性结果的确定 当样品cpm值小于控制点cpm值时，应首先同时测定一个阴性质控和一个阳性质控，测试的阳性质控应该小于控制点，以确定试剂和设备工作正常，再重新平行取样检测。如果重测样品的cpm小于控制点，且试剂和设备正常，则判定样品初筛阳性。改用LC-MS法进行确定。

1.2.6 交叉反应 分别将氯霉素、环丙沙星、链霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、红霉素、螺旋霉素标准储备液，添加到阴性样品中，配成含单一抗生素以及多种抗生素浓度为1000 μg/kg的饲料样品，样品处理及检测方法同1.2.2和1.2.3。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 将金霉素标准品添加入四环素阴性饲料样品中，使饲料的金霉素添加浓度分别为 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3中测定步骤检测其cpm值，结果见表1。

由于在CharmⅡ放射免疫分析中作为受体的细菌和被[3H］标记的抗原的量是固定的，因此当样品中竞争性抗原浓度增加时其竞争效率下降，Δcpm逐渐减少。

表1 金霉素添加浓度与cpm值的关系

2.2 加标实验 用50 μg/kg筛选水平，分别空白添加四环素、土霉素、金霉素以及它们混合标准，混标 1：土霉素∶四环素∶金霉素=4∶3∶3，混标 2：四环素∶土霉素∶金霉素=4∶3∶3，混标 3：金霉素∶土霉素∶四环素=4∶3∶3。 结果见表 2。

表2 筛选水平50 μg/kg的样品加标实验阳性检出率 %

从表2可以看出，无论是单标还是混标，在50 μg/kg筛选水平实验中结果均为阳性。

2.3 比对实验 在对用LC-MS法检测结束的50组留检样品，其中四环素类（总量大于50 μg/kg）阳性留检样品10组及阴性样品40组，用放射免疫法分析，结果见表3。

2.4 应用检测 以50 μg/kg作为筛选浓度，对20组市场购买的饲料进行筛选，其结果见表4。

表3 放射免疫法与LC-MS法对50组样品分析符合情况

表4 饲料中四环素类抗生素残留测定

用LC-MS方法验证5、10、18号样品的四环素类残留总量结果分别为 161.4、70.5、284.1 μg/kg；同时验证其余阴性样品，测定结果均小于50 μg/kg。表明应用情况良好，筛选结果可靠。

2.5 交叉反应 经过多次反复对1.2.6中其他族抗生素加标试验，与控制点cpm值进行比较，结果均为阴性。表明CharmⅡ四环素类抗生素放射免疫检测法特异性强，与本族以外的抗生素无交叉反应。

3 小结

目前在日常检测中阳性样品很少，因此检测发展的趋势是快速区分阳性与阴性样品。CharmⅡ放射免疫分析法是结合微生物学与免疫学各自的特点发展起来的。放射免疫检测法具有操作简单、速度快、分析成本低的优点，是目前使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法，该法适用于大量样品的筛选。饲料样品前处理简单、干扰因素小，只需简单处理便可检测，从接收样品到出结果，整个过程大约20 min。阴性结果不但表明该样品中含四环素族单种抗生素浓度分别小于50 μg/kg，同时也可表明，四环素族浓度总和不超过50 μg/kg。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一种很好的饲料中多种四环素类药物检测的快速筛选方法。

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