骨折一号方对家兔骨折VEGF和BMP 2表达影响的实验研究

易 洋,鲍运平,龚朝霞朱正荣,彭礼林,骆华松 (长江大学临床医学院荆州市第一人民医院骨科,湖北荆州434000)李军川 (长江大学临床医学院荆州市第一人民医院病理科,湖北荆州434000)

骨折一号方是我科协定方,临床实践证实其疗效卓著,为进一步深入研究骨折一号方的作用机理,我们设计了本次实验。采用家兔桡骨中下1/3处1.5mm骨质缺损的动物模型,应用组织学、免疫组化方法对骨折一号方对骨折愈合的作用和骨折愈合过程中骨痂血管内皮生长因子 (VEGF)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达的影响进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要实验药物 骨折一号方由荆州市第一人民医院制剂科提供。处方组成:泽兰、二花、红花、三七等。用传统煎药方法,制成含生药量为2g/ml,备用。生理盐水、青霉素 (华北制药)均由荆州市第一人民医院药剂科提供。

1.1.2 主要试剂及仪器设备 VEGF、BMP-2试剂盒 (即用型,武汉博士德生物有限公司提供)、台式自动平衡离心机LDZS-2(北京医用离心机厂)、HC-TP12B-1型天平 (北京医用天平厂)、全自动切片机RMZ145(德国莱卡)、电热恒温水箱BHW(北京市医疗设备厂)、全自动病理切片包埋机 (德国莱卡EGll60)、DJS-941型电动石膏锯 (长江大学提供)、电热鼓风干燥箱101A-1(上海市实验仪器总厂)、显微镜MICROPHOT-FXA(日本NIKON)、外科常用器械 (由长江大学分子生物学实验室提供)。

1.1.3 实验动物 选择健康8月龄雄性新西兰大白兔60只,体质量2.5～3.0kg,由长江大学医学院实验动物中心提供。动物饲养于清洁级环境下 (长江大学医学院实验动物中心),自由进食颗粒饲料,饮消毒水,室温控制在 (20±2)℃,湿度60%,12-12间隔照明,定期紫外线消毒与排风。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型 实验动物用0.3%戊巴比妥钠按30mg/kg体质量耳缘静脉注射麻醉后建立动物模型,右侧桡骨术野处剪毛,2%碘酒、70%酒精消毒,取前臂外侧切口,暴露桡骨中段,注意保护桡动、静脉,用两把骨膜剥离子将桡骨撬起,DJS-941型电动石膏锯造成桡骨中段1.5mm的骨缺损。以出现假性关节为准。彻底止血,关闭切口。手术过程均在严格无菌条件下进行。术后分笼饲养,自由进食,不做固定。术后进行3d抗感染治疗,给予青霉素80万单位肌肉注射,1次/d。造模成功后随机分为3组,空白组 (A组)、生理盐水对照组 (B组)和骨折一号方组 (C组),每组20只。

1.2.2 给药方法 用传统煎药方法,制成含生药量为2g/ml,按 “动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”[1]折算成等效剂量,2ml/100g体质量灌胃,从造模后第1天开始,2次/d,直至动物被处死。

1.2.3 标本处理 术后第3、6、9、14天每组随机抽取5只家兔,采用空气栓塞法处死,取样时均截取右侧桡骨,包括原骨折断端及远近端各长约1.5cm的正常骨质,并剔除其上的软组织。置于质量分数为40g/L的多聚甲醛 (含1‰DEPC)4℃下固定24h。

1.2.4 组织学检查 以骨折端中央为中心纵行剖开骨段,经系列酒精脱水、透明、浸蜡,剖面向下,低熔点石蜡包埋。用莱卡自动切片机切成厚度6μ m的蜡片,将蜡片分别展于经多聚赖氨酸处理的载玻片上,标明相应的组织号码,置于干燥箱中,42℃烤片48h。采用HE染色对各组标本的骨折愈合情况进行观察评价。

1.2.5 VEGF表达检测 采用武汉博士德生物有限公司生产的VEGF免疫组化S-P试剂盒对标本VEGF的表达进行免疫组化检查。

1.2.6 BMP-2表达检测 采用武汉博士德生物有限公司生产的BMP-2免疫组化S-P试剂盒对标本BMP-2的表达进行免疫组化检查。

1.2.7 图像分析 NIKON MICROPHOT-FXA显微镜的光源设定在电压4.9V,物镜固定为×40,光栅孔径为0.25mm,曝光时间为0.165s,色温为5500K,敏感度为M。拍摄在摄像机的镜头打开无组织和镜头完全被遮蔽状态下的照片,作为光密度分析中黑色阶和入射色阶的校准图像。以骨折为中心对骨折断端附近的骨干细胞、骨外膜、骨内膜、血肿、纤维骨痂、软骨骨痂、骨小梁、小梁间组织及骨髓组织各取两个高倍镜视野。用Imagepro Plus 5.0图像分析软件,对阳性反应细胞的平均光密度值(MOD)进行分析。简要分析步骤:打开Imagepro Plus 5.0图像分析软件,用校准图像的灰度值设定光密度系统的黑色阶和入射色阶,并将光密度设为系统默认值。打开需要测量的图像,用选择颜色中的吸管工具选择图像中的棕黄色阳性反应区域,并保存选择的颜色数据,根据大量图像调整颜色数据,确定标准数据,其他图像用此数据自动选取图像中阳性表达区域。使用AOI工具划定需要测量的组织范围,并手工去除噪点后计算该组织阳性表达细胞的MOD值,保存测量结果。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 HE染色结果

术后第3天,各组切片显示以纤维组织为主,可见间充质细胞增殖活跃,内有毛细血管及炎性细胞;术后第6、9天,骨折一号方组胶原纤维较多,分化较成熟,对照组胶原纤维较少。术后第14天,骨折一号组有大量软骨细胞及成骨细胞,成纤维细胞多呈圆形,成骨细胞较大,细胞外基质生成较多;空白组及对照组胶原纤维较多,软骨细胞和成骨细胞数量相对较少,排列稀疏。

2.2 各组标本骨干细胞VEGF表达

各组标本在骨折愈合不同时间点骨干细胞VEGF表达情况见表1。

2.3 各组标本骨干细胞BMP-2表达

各组标本在骨折愈合不同时间点骨干细胞BMP-2表达情况见表2。

表1 不同观察时间各组标本骨干细胞VEGF表达情况

表2 不同观察时间各组标本骨干细胞VEGF表达情况

3 讨 论

骨折愈合是一个复杂过程,经胶原合成、胶原纤维内钙化、骨化等,最终形成具有生物力学特性的骨组织[2]。近年的研究已经证明,影响骨折愈合的因素有很多,但目前一般认为血管方面因素可能是影响骨折修复的主要因素之一。已有研究表明,EGF可以促进创伤后的血管生成和骨形成[3-4]。

本实验中VEGF表达检测结果显示,骨折后断端均有VEGF表达。术后第3、9天出现两个峰值。我们对各时相点VEGF表达量作比较分析后发现,试药组较对照组各时相点VEGF表达量均明显增高,表明骨折一号方有促进骨折后VEGF表达的作用,且在VEGF表达量下降过程中可明显减慢下滑速度,使局部VEGF高表达维持较长时间 (术后第14天)。我们推断,骨折一号方在骨折愈合过程中,具有正向调高VEGF表达水平的能力,同时可减缓表达峰值后表达量下降的速度,延长局部VEGF高表达时间,促进骨折断端微血管新生增殖,使骨折断端血循环重建及成骨过程加快,缩短骨折愈合时间。

BMP-2是公认的最主要的骨形成调控因子,体内和体外实验都证明BMP-2有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力[5-6]。本实验BMP-2表达检测结果显示,骨折后断端均有BMP-2表达。我们所观察的各时相点未出现峰值,而是呈两条近乎平行线,随时间的推移而呈增高趋势。这可能与我们所选的观察时相点相对短有关。在各时相点,骨折一号方组BMP-2表达均高于对照组和空白组 (P＜0.05)。由此推测,骨折一号方对BMP-2的合成、分泌具有一定的干预作用,能增加其表达量,从而促进骨折愈合和缩短骨折愈合时间。

综上所述,骨折一号方能显著增高骨折愈合各时相点VEGF、BMP-2的表达量,使骨折断端血循环重建及成骨过程加快,这可能是其产生临床疗效的机制之一。本实验仅研究了骨折一号方对骨折早期的影响,其对骨折中后期的影响有待进一步探讨。

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