核心蛋白聚糖对骨性关节炎中软骨修复作用的形态学研究

熊 雁，龚 滨，王子明，杜全印，王爱民

随着社会的现代化进程和人口的老龄化，由于退变引起的骨性关节炎中软骨缺损的患者显著增多，因此如何解决关节软骨修复的问题日益显得重要。关节软骨属于透明软骨，软骨细胞是高度分化的组织细胞，成熟的关节软骨中软骨细胞的分裂能力非常有限，因此软骨损伤后修复能力差［1］。

最近多个研究表明:在骨关节炎患者的关节软骨中，做为转化生长因子(transforming growth factor，TGF)调节因子的核心蛋白聚糖(decorin，DCN)的mRNA含量增加，DCN的蛋白含量减少，而且DCN的分解片段随年龄增加而增加［2－4］。这些结果提示，在骨关节炎患者的软骨修复过程中，DCN可能起到重要的修复作用。因此，我们建立了大鼠骨关节炎软骨缺损的模型，观察DCN对软骨缺损修复的作用。

材料与方法

1 实验材料

清洁级SD(Sparague－Dawley)大鼠30只，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，雌雄不限，体重(150±10)g，常规饲养1周后，用于实验。木瓜蛋白酶(papain)、DCN、TGF均购于Sigma公司。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立 取10只SD大鼠，用4%的木瓜蛋白酶20U分别于第1、4、7天注射进SD大鼠膝关节;建立骨性关节炎动物模型。右手抓住大鼠颈部皮肤和尾部，行1%氯胺酮(l00mg/kg)腹腔麻醉后，将实验鼠仰卧位固定于手术台上，用刀片将手术区域及周围皮毛剃净，湿纱布洗净，然后分别用碘酒、乙醇消毒右后膝关节，术者戴手套，铺无菌洞巾，右膝关节微屈，50μl微量注射器在髌骨下方进针，针尖向中、向上倾斜穿刺进入关节腔内注射药物。左膝关节腔注射生理盐水20μl作为对照。

注射后第2、4周各随机挑选5只大鼠断头法处死，处死后在膝关节外约0.5cm处用锐利器械切断，小心取出关节标本，10%多聚甲醛固定，将固定好的标本放入磷酸盐缓冲液(PBS)配制的0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH 7.8)中脱钙30天，中间更换脱钙液1次，脱钙完全后用手术刀片取材，垂直于关节软骨面切开，切成1.0cm×0.5cm×0.2cm，自动脱水机梯度脱水，石蜡包埋，常规病理切片，5μm连续切片。常规脱蜡脱水后，苏木精-伊红(HE)染色，观察软骨情况，明确骨性关节炎动物模型的建成。

2.2 动物分组实验 4周后，把剩下20只SD大鼠随机分成2组，每组10只大鼠，右侧膝关节腔第1、4、7天注射相应的试剂:(1)核心蛋白聚糖(DCN)组(100μl，0.1mg/ml)，作为实验组;(2)转化生长因子(TGF)组(100μl，0.1mg/ml)，作为治疗对照组。左膝关节为生理盐水组，作为空白对照。

2.3 软骨修复情况检测 动物分别在注射试剂后2周和4周处死，膝关节标本整体取下行大体观察后固定，行HE染色。据国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society，ICRS)规定标准进行组织学评分［5－6］。ICRS评分项目是:关节软骨表面、基质、细胞分布、活力细胞数量、软骨下骨、软骨矿化情况。

3 统计分析

结 果

1 动物模型的建立

实验动物无意外死亡，动物模型建立成功。注射木瓜蛋白酶后第2周，动物实验侧关节有较明显肿胀，关节活动灵活性降低，步态轻度异常;第4周活动频次较第2周稍增多，活动基本正常，步态基本正常，实验侧关节肿胀不明显。肉眼大体观察两组标本，第2周实验侧关节较对照侧，边缘软骨表面局部小区域有轻度剥脱，光滑度降低。第4周实验侧关节较对照侧，软骨表面局部区域有剥脱，光滑度明显降低。

光镜下观察，正常对照侧组织学观察见关节结构正常，关节软骨表面光滑连续，基质透明，细胞分布呈柱状，活力细胞占大多数，软骨下骨正常，软骨矿化正常。木瓜蛋白酶作用2周后见骨层清晰，但关节软骨表面不连续，基质透明，细胞分布呈柱状，活力细胞开始下降，软骨下骨正常，软骨矿化正常;作用4周后见骨层不清晰，关节软骨表面不规则，基质混杂，细胞分布呈柱状，活力细胞明显下降，软骨下骨重塑增加，软骨矿化局部不规整。

2 大体观察

肉眼大体观察，试剂注射后2周，TGF组、DNC组实验侧关节较对照侧局部缺损区均有轻度修复，光滑度好转，其余未见明显差异。试剂注射后4周2组对照侧均比实验侧软骨表面局部区域剥脱更明显，光滑度降低，实验侧软骨表面修复明显，光滑度明显好于对照侧。

3 组织学观察

模型建立后，试剂注射术后2周光镜下观察，DCN组实验侧比对照侧，关节软骨表面较光滑连续，但是在基质、细胞分布、软骨下骨、软骨矿化等方面的差异ICRS评分均无显著统计学意义。TGF组实验侧比对照侧，关节软骨表面更光滑连续，其ICRS评分差异有统计学意义，P＜0.05(表1，图1～4)。

试剂注射术后4周光镜下观察，DCN组实验侧比对照侧，关节软骨表面更光滑连续，基质更透明，细胞分布成簇较少，软骨下骨重塑好，各项ICRS评分差异均有统计学意义，P＜0.05，但软骨矿化的差异ICRS评分无显著统计学意义。TGF组与DCN组的结果相似，但是TGF组实验侧的软骨基质层改变更厚(表2，图5～8)。

表1 注射术后2周两组ICRS组织学评分(n=5，±s)

表1 注射术后2周两组ICRS组织学评分(n=5，±s)

与对照组相比:*P＜0.05

组别 关节表面 基质 细胞分布 活力细胞数量 软骨下骨 软骨矿化DCN组实验侧3.0±0 2.2±0.4 2.4±0.5 3.0±0 2.6±0.4 3.0±0 DCN组对照侧 1.2±1.6 1.4±0.5 1.6±0.5 2.2±1.1 2.6±0.5 2.4±1.3 TGF组实验侧 3.0±0* 2.2±0.4 2.4±0.5 3.0±0 2.8±0.4 3.0±0 TGF组对照侧 0.6±1.3 1.8±0.4 1.6±0.5 2.6±0.9 2.6±0.5 2.4±1.3

表2 注射术后4周两组ICRS组织学评分(n=5，±s)

表2 注射术后4周两组ICRS组织学评分(n=5，±s)

与对照组相比:*P＜0.05

组别 关节表面 基质 细胞分布 活力细胞数量 软骨下骨 软骨矿化DCN组实验侧 3.0±0 2.8±0.4* 2.8±0.4* 3.0±0* 2.8±0.4*3.0±0 DCN组对照侧 0.6±1.3 1.4±0.5 1.2±0.4 1.0±0 2.0±0 1.2±1.6 TGF组实验侧 3.0±0* 3.0±0* 2.8±0.4* 3.0±0* 2.8±0.4* 3.0±0 TGF组对照侧 0.6±1.3 1.4±0.5 1.4±0.5 1.4±0.9 1.8±0.4 1.8±1.6

图1 注射2周后DCN实验侧组织学(HE×100)

图3 注射2周后TGF实验侧组织学(HE×100)

图4 注射2周后TGF对照侧组织学(HE×100)

图5 注射4周后DCN实验侧组织学(HE×100)

图6 注射4周后DCN对照侧组织学(HE×100)

图7 注射4周后TGF实验侧组织学(HE×100)

图8 注射4周后TGF对照侧组织学(HE×100)

讨 论

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性骨关节炎(degenerative arthritis)是最常见的关节疾病，在美国50岁以上的人口中，骨关节炎的发病率居全部病种中的第2位，而在美国65岁以上有影像学异常的人群中，骨关节炎约占70%［1］。随之而来，全球范围内由于骨关节炎带来的医疗负担大幅增长。因此，探讨OA的病理过程，明确软骨破坏及修复的机制，对于OA的防治具有重大的社会意义。

1 动物模型

制作骨性关节炎动物模型的方法很多，主要有Hulth模型手术法、关节制动法、药物注射法等。本实验采用关节腔内注射木瓜蛋白酶的方法复制骨性关节炎动物模型。许多研究表明，骨关节炎软骨最早期发生的显著的变化之一是蛋白多糖减少，而木瓜蛋白酶可以分解软骨基质中的蛋白多糖，使其从软骨中丢失，因此木瓜蛋白酶这种造模方法与骨关节炎发生过程类似，是研究OA比较好的方法。有研究表明:木瓜蛋白酶在成年兔、豚鼠的膝关节腔内注射后可引起骨关节炎，且骨关节炎发生时间短，重复性好［7］。

2 软骨修复过程中DCN的作用

DCN是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族(small leucine rich proteoglycans，SLRP)中的一员，主要分布在骨、软骨、肌腱、巩膜等结缔组织，属于细胞外基质(ECM)。由于电镜下显示其在胶原网络中能够修饰胶原纤维，故又称为饰胶蛋白聚糖。正常关节软骨表面光滑，呈现蓝白色，由软骨基质和镶嵌在软骨基质陷窝内的软骨细胞组成，软骨基质由胶原纤维、蛋白聚糖和水分构成。蛋白聚糖镶嵌于胶原纤维网状结构中，在关节软骨受挤压时，网状结构中的水分挤出，而在休息时又可从关节滑液中吸收水分，并使软骨细胞获得营养。正常情况下，软骨细胞分泌合成的软骨基质和软骨基质的降解保持平衡，使得关节软骨光滑有弹性，可发挥保护、减轻震荡和减少摩擦等重要生理作用。

另一方面，多个研究表明:在骨性关节炎患者中，TGF-β的过多表达或者是表达减少都和骨性关节的发展相关［8］。因此，维持TGF-β的表达水平的平衡是维持关节软骨代谢稳态的关键。DCN作为ECM组分对TGF-β功能起重要反馈调节作用，其机制可能是:(1)DCN通过其核心蛋白与TGF-β1结合，将该因子结合到ECM(作为其贮存库)，调节TGF-β1利用度;(2)TGF-β1-decorin复合物通过识别DCN的受体被细胞内吞而控制TGF-β1的稳定水平;(3)DCN与TGF-β1结合可以直接中和其活性。因此理论上，DCN可以与TGF-β的相互作用，维持TGF-β的表达水平的平衡，修饰胶原纤维成熟，达到稳定软骨胶原、修复关节软骨缺损的作用［8－9］。

最近多个研究表明:在OA患者的关节软骨中，DCN的mRNA含量增加，DCN的蛋白含量减少，而且DCN的分解片段随年龄增加而增加［2－4］。这些结果提示:在OA患者的软骨修复过程中，DCN可能起到重要的修复作用。我们的初步形态学研究提示:在大鼠模型中，DCN能促进骨关节炎模型中软骨表面更加光滑，基质更透明。因此，DCN对于软骨表面的修复能起到良好的效果，其机制可能是通过对TGF-β调节及胶原的稳定起到作用，但需进一步研究。因此，探讨DCN修复骨性关节炎中软骨缺损的机制，可能将为临床上骨关节炎患者的治疗提供新的策略。

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