负压封闭引流技术对兔外周血炎症因子的影响

杨 帆，胡 耑，白祥军，李 波，李仁杰，张 锟，薛晨晨

负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)技术是一种负压创面治疗的物理方式，经过10余年的应用和推广，已经在创面修复方面取得了巨大的成功［1－3］。同时我们在临床上发现VSD还可以降低患者全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症(sepsis)的“二次打击”［4－5］。白细胞计数(white blood cell，WBC)和C反应蛋白(C reactive protein，CRP)能够有效监测炎症反应和感染发生;而肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)则是炎症网络中的核心代表。本实验通过前瞻性对照研究，观察VSD技术对兔创伤模型外周血WBC、CRP、TNF-α和IL-6的影响，探讨VSD技术对感染、炎症的影响并探讨其可能机制。

材料与方法

1 实验动物

12只普通级健康日本大耳白兔，体质量2.5～3.5 kg，雌雄不限，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物质量合格证号SCXK(鄂)-2008-0005-0007101。

2 动物建模和分组

8%硫化钠于兔背部脱毛并适应性喂养1周后称重，氯胺酮30mg/kg耳缘静脉注射麻醉，兔背部脱毛区消毒，全层切开皮肤直至肌肉层，形成2cm×2cm的创面，压迫止血。

12只建模后实验兔随机分为:(1)常规组6只，创面每日行常规换药;(2)负压组6只，创面行VSD手术后持续以－193.75mmHg(25.8kPa)的负压吸引，如VSD有漏气和敷料堵塞，则及时更换。设定建模前12只实验兔为正常对照，检测各兔外周静脉血中WBC计数、CRP、TNF-α和IL-6的正常含量。

上述实验兔均在特制单笼条件中进行饲养，有效避免创面污染和贴膜破损漏气。一旦实验过程中出现标本溶血、凝固则立即重新采集，若实验兔死亡，则重新入组新实验兔进行补充实验。

3 主要仪器、材料和试剂

3.1 仪器:便携式负压吸引仪(武汉维斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自动血细胞分析仪(美国Abbott公司)、Aeroset全自动生化分析仪(美国Abbott公司)、BNⅡ特种蛋白分析仪(德国Siemens公司)、Labofuge 400R台式冷冻离心机(德国Heraeus公司)、Denley dragon wellscan MK3酶标仪和Ascent software for multiskan分析软件(芬兰Thermo公司)。

3.2 材料:VSD一次性使用负压引流护创材料(武汉维斯第公司)、特制饲养笼(武汉同济医院)。

3.3 试剂:CRP检测试剂盒(美国Dade behring公司)、TNF-α检测ELISA试剂盒(北京博奥森公司)、IL-6检测ELISA试剂盒(北京博奥森公司)。

4 标本的采集和测定

4.1 WBC血液标本:负压组和常规组于建模后7天内各时间点(6、12小时、1、3、5、7天)，于兔耳缘静脉抽取外周静脉血1ml，注入血常规试管，4℃保存，60分钟内送检。应用Cell-PYN Sapphire全自动血细胞分析仪自动进行兔外周静脉血中WBC计数。

4.2 CRP血液标本:负压组和常规组于建模后7天内各时间点(6、12小时、1、3、5、7天)，于兔耳缘静脉抽取外周静脉血1ml，4℃、3 000rpm离心5分钟取上清，4℃保存，60分钟内送检。采用动态定时散射比浊法，应用BNⅡ特种蛋白分析仪及CRP试剂盒自动检测兔外周静脉血中CRP含量。

4.3 TNF-α和IL-6血液标本:负压组和常规组于建模后7天内各时间点(6、12小时、1、3、5、7天)，于兔耳缘静脉抽取外周静脉血1ml，4℃、3 000rpm离心5分钟取上清，－80℃冷冻保存待测，避免反复冻融。以ELISA法检测，采用北京博奥森公司TNF-α和IL-6检测试剂盒，严格按照试剂盒说明操作。

同时以建模前兔外周静脉血为对照(0秒)，同上操作采集和测定相关标本。

5 统计学分析

应用SPSS 13.0软件，WBC计数、CRP、TNF-α和IL-6的含量均用均数±标准差(±s)表示，计量资料的比较采用t检验分析，P＜0.05作为具有统计学意义的标准。

结 果

1 负压组和常规组外周静脉血WBC计数和CRP含量的变化(见表1)

由表1可知，建模前两组外周血WBC计数和CRP含量无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。自6小时时间点起负压组的外周血WBC计数和CRP含量较常规组显著性降低，且具有统计学意义(P＜0.05)。

2 负压组和常规组外周静脉血TNF-α和IL-6含量的变化(见表2)

由表2可知，建模前外周静脉血TNF-α和IL-6含量无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。建模后两组TNF-α和IL-6含量均开始增高。自1天时间点起负压组的外周静脉血TNF-α含量较常规组显著性降低，且具有统计学意义(P＜0.01)。自6小时时间点起负压组的外周静脉血IL-6含量较常规组显著性降低，且具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 外周静脉血WBC计数和CRP含量的变化(n=6)

表2 外周静脉血TNF-α和IL-6含量的变化(n=6)

讨 论

严重创伤患者由于病程中经历创伤和失控性炎症的双重打击［6］，易导致炎症递质的异常表达和发生序贯性的多器官功能障碍综合征(MODS)，临床上治疗极其棘手，很大一部分患者死于继发的多脏器衰竭(MOF)，成为复苏后期的主要死因。我们在临床上观察到，VSD技术不仅有助于促进肉芽组织和创面生长，而且可以显著降低SIRS、脓毒症和MODS的发生率，这可能同局部负压治疗参与全身炎症因子信号的调控相关［7］。我们通过观察WBC和CRP作为VSD术后感染指标，TNF-α和IL-6在外周血中含量的变化，研究VSD技术对感染和炎症的干预效果并探讨其可能机制。

1 白细胞计数和C反应蛋白

当机体遭受创伤或者细菌入侵后，以中性粒细胞为首的WBC群，通过细胞吞噬与增强炎症反应，共同消灭细菌，预防感染，是一种非特异性免疫的直接效应细胞。活化的WBC还可以通过释放炎症介质、增加血管通透性、产生趋化作用等参加局部的炎症反应。

CRP是在IL-6等细胞因子调节下，主要由肝脏合成分泌的一种蛋白质，也可由炎症局部的巨噬细胞少量产生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增强白细胞的吞噬能力、增强淋巴细胞活性、激活补体等作用。大量研究表明，但当机体存在创伤、感染、急性炎症等应激情况时，CRP是急性时相蛋白(acute phase protein，APP)中变化最敏感的一种，也是目前评价炎症和感染程度最为敏感的指标［8］。

我们的研究表明，自建模后6小时起负压组的外周血WBC计数和CRP含量较常规组显著性降低(P＜0.05)。这可能同以下机制相关［9］:(1)贴膜可将创面与外界隔绝，以防止清创后的创面进一步被污染，减少创面细菌附着数量，预防感染发生;(2)持续负压吸引可清除创面坏死物质和渗出液，以及其中的细菌，直接减少创面细菌数量和细菌培养基，从而避免感染发生和WBC升高;(3)及时清除富含炎症递质的渗出液和坏死物，亦可降低CRP的反应性分泌。

2 TNF-α和IL-6

炎症递质通过相互调节形成复杂的网络系统，TNF-α和IL-6是共同参与创伤后机体炎症反应的主要细胞因子。适当的炎症反应可以将细胞因子水平维持在适当的水平，有利于细胞免疫和机体恢复;如果过度释放和调节失控，则会诱发SIRS。所以有效调控这些炎症细胞因子含量，是控制全身失控性炎症反应和预防MODS的关键［10］。

我们的研究表明，建模前外周静脉血TNF-α含量非常低，一旦发生创伤应激，TNF-α的含量迅速升高，12小时即达到基础值的6～7倍，随后迅速下降，1天后各时相点上，两组比较其差异有统计学意义(P＜0.01)。这可能与TNF-α作为启动因子，在创伤后炎症反应早期(12小时内)受创面大小和血管内皮损伤程度的直接调控;在无干预措施的对照组，炎症反应持续时间长，各种炎症递质互相作用，即开始产生“瀑布样”效应，刺激TNF-α等炎症因子迅速、大量释放;相反，负压组由于VSD持续清除创面富含炎症因子的坏死物质和渗出液，切断了TNF-α进一步放大的通路，迅速下调TNF-α及其含量，控制了炎症反应持续发展。而外周静脉血IL-6含量变化，在建模前两组含量相近，但自6小时时相点起负压组的外周静脉血IL-6含量较常规组显著降低(P＜0.05)。可能机制有:IL-6受到机体应激和炎症因子双重调控，虽然在早期(12小时内)两组的TNF-α含量无显著性差异，但是应激状态已经开始发生变化，负压组刺激源强度下调，导致建模后IL-6含量也持续较常规组减低。

综上所述，WBC、CRP、TNF-α和IL-6不仅是感染和炎症反应程度的重要评估指标，而且由于之间互相作用和调控，共同参与了感染和炎症反应的全过程，可能在SIRS、脓毒症和MODS的发生发展中起着重要作用。而VSD技术能够在创伤早期通过清除病因，以削弱应激源的放大作用，避免了失控性炎症反应和MODS的发生，有利于创面的愈合。

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