脂肪酶法制备生物柴油的研究现状及展望

王昌梅，张无敌，陈玉保，尹 芳，徐 锐，刘士清

(云南师范大学 太阳能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制备生物柴油的研究现状及展望

王昌梅，张无敌，陈玉保，尹 芳，徐 锐，刘士清

(云南师范大学 太阳能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制备生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、甘油易回收和无废物产生等特点。对用于制备生物柴油的脂肪酶类型(动物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶)、用于脂肪酶法制备生物柴油的原料油脂类型(植物油脂、动物油脂、微藻油脂及废弃油脂)以及脂肪酶法制备生物柴油的方式(游离脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法、复合脂肪酶协同催化法)进行了综述;并提出了脂肪酶法制备生物柴油的研究与发展方向，如对酶制剂的研究、生物柴油原料的解决以及对脂肪酶的使用方式进行改进，为今后脂肪酶法制备生物柴油的研究提供思路。

脂肪酶;生物柴油;酶催化;酯交换

生物柴油与传统的石化柴油相比具有很多优点，发展生物柴油在我国具有巨大的潜力［1］。生物柴油主要是以动、植物油为原料，通过转酯化反应制备成的长链脂肪酸酯类物质(脂肪酸甲酯或乙酯)。目前生物柴油的制备方法主要有化学法和生物酶法。化学法生产工艺较成熟，是目前制备生物柴油常用的方法;但化学法存在能耗高、工艺复杂、醇消耗量大、污染环境等缺点。生物酶法制备生物柴油是利用脂肪酶的催化作用，实现油脂与短链脂肪醇的转酯化反应，具有反应条件温和、醇用量少、产物易分离、环保等优点。脂肪酶法对原料要求低，游离脂肪酸完全可以被脂肪酶直接酯化，副产物甘油分离简单，降低了生产工艺要求和生产成本，因而脂肪酶法制备生物柴油被认为是取代化学法生产生物柴油的绿色工艺［2］。但脂肪酶法合成生物柴油也存在一些缺点：目前使用的脂肪酶仅对长链脂肪醇的转酯化反应有效，而对短链脂肪醇的转化率低;短链脂肪醇对脂肪酶有一定的毒性，使脂肪酶的使用寿命缩短;副产物甘油和水不但抑制产物形成，而且甘油对脂肪酶有毒性，也影响脂肪酶的使用寿命［3］。

本文对脂肪酶法制备生物柴油的研究现状进行了综述，并提出了将来的研究方向。

1 脂肪酶法制备生物柴油研究现状

脂肪酶全称为甘油三酰水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解为甘油和脂肪酸。脂肪酶最早应用于油脂工业是催化油脂水解生产脂肪酸［4］。随着非水相酶学研究的深入以及对脂肪酶催化过程的热力学和动力学的研究，发现在一定的反应体系中，利用脂肪酶的催化作用，还可实现油脂与短链醇的酯交换反应，用于制备生物柴油［5］。脂肪酶催化制备生物柴油的反应机理通常认为是多个顺序水解和酯化过程，即在酶催化微水环境中，三甘酯先水解成二甘酯和脂肪酸，然后脂肪酸和短链醇酯化合成脂肪酸烷基酯;二甘酯继续水解成单甘酯和脂肪酸，脂肪酸再与短链醇酯化合成脂肪酸烷基酯;依次进行顺序水解和酯化反应，直到甘油酯完全水解为甘油，产生的脂肪酸完全酯化合成脂肪酸烷基酯。甘油酯与短链醇还可以直接进行酰基转移，因为醇作为酰基受体，除了参与和脂肪酸的酯化过程，同时有可能与水竞争获得甘油酯的酰基，即不经水解步骤直接产生脂肪酸烷基酯和二甘酯。

1.1 用于制备生物柴油的脂肪酶

脂肪酶广泛存在于动物肝脏、植物种子和微生物中［5］。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活性。目前，用于催化制备生物柴油的脂肪酶主要有Novozym 435［6-7］、南极假丝酵母Candida antarctia［8-9］、Candida rugosa［10］、固定化假丝酵母Candida sp.99-125［11］、米根霉Rhizopus oryzae［12-13］、米 根 霉 IFO4697［14-15］、 华 根 霉 CCTCC M 201021［16］、葡枝根霉 YF6［17］、洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia［18-21］、荧 光 假 单 胞 菌LipB52［22］;此外，还有猪胰脂肪酶［23-24］、Penicillium Expansum TS414［25］和Enterobacter agglomerans［26］。它们催化油脂转酯化反应得到脂肪酸甲酯的收率一般为70% ～100%［27］。

1.2 用于脂肪酶法制备生物柴油的原料油脂

1.2.1 植物油脂

来源于植物的油脂是较好的制备生物柴油的原料。生产生物柴油原料的植物要具备生长快、单产高、含油量高的条件。不饱和脂肪酸含量高的油脂可避免冬季气温下降而凝固，油酸含量高的油脂所制备的生物柴油具有良好的贮存稳定性及燃烧特性［28］。大豆油、棕榈油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、菜籽油、花生油、蓖麻籽油皆可作为脂肪酶法制备生物柴油的原料。此外，一些木本植物油脂(如桐油、麻疯树籽油)，其中含有佛波酯而不可食用，但油酸含量较高，也是制备生物柴油较好的原料［12］。刘伟涛等［29］研究了固定化Lipozyme TLIM和Novozym 435脂肪酶催化毛棉籽油和乙酸甲酯制备生物柴油，生物柴油收率达到91.83%。李俊奎等［30］研究了以石油醚提取的小桐子毛油和甲醇为原料，利用固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化合成生物柴油，最高收率可达93%;该脂肪酶连续使用14个批次，生物柴油收率仍可保持在70%以上。

1.2.2 动物油脂

动物油脂中饱和脂肪酸含量较高，是制备生物柴油的原料之一。但目前以动物油脂为原料，采用脂肪酶法催化制备生物柴油的报道并不多。Lu等［31］以猪油为原料，在Candida sp.99-125脂肪酶催化下制备生物柴油，生物柴油收率达87.4%。Shimada等［32］以金枪鱼油为原料，采用固定化Candida antarctica脂肪酶逐步醇解工艺，生物柴油收率达90%。俞凌云等［24］以混合猪油、菜籽油为原料，采用猪胰脂肪酶催化制备生物柴油，油脂转化率偏低，只有36%。

1.2.3 微藻油脂

微藻油脂是制备生物柴油的另一原料来源。Li等［33］报道，利用Chlorella protothecoids微藻油脂，在固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化下制备生物柴油，油脂转化率达98%，且该微藻油脂中的油脂质量分数达44%～48%(基于细胞干重)。借助基因工程和遗传工程技术及光照培养技术，培养繁衍能力强、油脂含量高、生长周期短的工程微藻，降低微藻生物柴油的生产成本，比用植物油脂生产生物柴油更具有商业竞争力。

1.2.4 废弃油脂

餐饮业废弃的食用油、地沟油以及植物油脂加工后的油脚可作为制备生物柴油的原料。虽然原料成本低，但这些原料中聚合物和游离脂肪酸含量高、黏度大，进行转酯化反应前必须进行预处理，如用硅酸镁吸附除去游离脂肪酸等杂质，否则易导致催化剂失活［34］。韩春阳等［35］以餐饮废油为原料，用固定化Novozym 435与TLIM脂肪酶催化制备生物柴油，脂肪酸甲酯收率达85.7%;该脂肪酶在连续反应266 h后，催化活性基本没有下降。苏敏光等［36］利用中性脂肪酶催化泔水油与甲醇反应制备生物柴油，生物柴油收率可达89.7%以上。

1.3 脂肪酶法制备生物柴油的方式

1.3.1 游离脂肪酶法制备生物柴油

游离脂肪酶通过催化双相体系油水界面的转酯化反应制备生物柴油。基于油水界面活化效应的特点，脂肪酶催化制备生物柴油的反应速率较快，不受底物和产物的扩散限制，产物与副产物分离简单。Kaieda等［37］利用游离 Rhizopus oryzae脂肪酶催化大豆油和甲醇的转酯化反应时发现，水的存在(质量分数为4%～30%)有利于反应的进行。他们还比较了 3种游离脂肪酶 Candida rugosa，Pseudomonas cepacia，Pseudomonas flurescenes在无溶剂体系中催化大豆油和甲醇转酯化反应的性能，发现 Pseudomonas cepacia和 Pseudomonas fluorescenes脂肪酶对甲醇的稳定性非常好，其中又以Pseudomonas cepacia脂肪酶的稳定性最好，大豆油的转化率最高。苏敏光等［36］利用游离中性脂肪酶催化泔水油与甲醇反应制备生物柴油，通过正交实验获得最佳反应条件：油与醇的摩尔比1∶3，油与酶的质量比1∶1，温度45℃，油与溶剂的质量比1∶0.6。在此条件下反应10 h，生物柴油收率可达89.7%以上。吴良彪［38］利用游离脂肪酶催化食用废油与甲醇反应制备生物柴油，得到最佳反应条件：温度50℃，脂肪酶催化剂用量为原料质量的3%，甲醇与食用废油的体积比为3∶1，共溶剂丁酮与甲醇的体积比为1∶6，pH=7，反应时间4 h。在此条件下，生物柴油收率达78%，产品的各项指标均与 0#石化柴油相接近。吕丹等［39］采用游离NS81006脂肪酶催化含酸油脂制备生物柴油，生物柴油收率达 90%，通过离心分离可有效实现NS81006脂肪酶的回收使用，连续回用5个批次，游离脂肪酶活性未出现明显下降。

游离脂肪酶在反应体系中分散不均匀且容易聚集结块，不利于回收和重复利用;并且甲醇对脂肪酶具有失活效应，限制了脂肪酶在工业规模生物柴油生产中的应用。通过固定化技术和全细胞催化剂的采用、甲醇流加方式的改进等手段，可改善脂肪酶的催化活性和稳定性，从而降低生产成本，加快生物柴油工业化进程。

1.3.2 固定化脂肪酶法制备生物柴油

酶是高效、专一性强的生物催化剂，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能起一次催化作用。同时酶是蛋白质，在高温、高离子浓度、强酸、强碱等条件下及部分有机溶剂中均不稳定，容易失活而降低其催化活性，这些不足大大限制了酶促反应的广泛应用［40］。20世纪70年代出现的固定化酶技术克服了游离酶的不足。固定化细胞技术是指用物理或化学方法将游离细胞固定于限定的空间区域，并使固定后的细胞拥有良好的催化活性和重复使用性的一种方法［41］。近年来在生物柴油的制备研究中固定化酶有所应用，有望成为一种新型、高效、无污染、低成本的生物柴油工业化生产方法［42-44］。

溶胶-凝胶法制备固定化脂肪酶工艺简单，固定化脂肪酶的力学性能稳定、生物相容性好，已成为脂肪酶固定化的热点研究领域之一。Noureddini等［19］利用以四甲氧基硅烷和异丁基三甲氧基硅烷为前体的溶胶-凝胶法固定Pseudomonas cepacia脂肪酶，并催化大豆油转酯化反应，脂肪酶的稳定性和催化活性显著提高，重复使用11次后，活性仅丧失5%。Yagiz等［45］以人工合成水滑石为载体固定化Lipozyme TLIM脂肪酶，考察了温度、pH、粒径、时间对固定化效率的影响，并用该固定化脂肪酶催化废油脂的转酯化反应，室温(24℃)下反应105 h后转化率达92.8%，重复使用7次后，残余酶活为36%。高阳等［46］以非极性大孔树脂 NKA为载体，用物理吸附法固定化Candida sp.99-125脂肪酶，该法简便易行，在低水含量的庚烷体系中进行大豆油的转酯化反应，单批转化率为97.3%，连续反应19个批次，转化率为70.2%，残余酶活为85.1%。张宝华等［47］以丝瓜络为载体，对Pseudomonas fluorescens脂肪酶进行固定化，并催化餐饮废油制备生物柴油，在40℃、醇与油的摩尔比3∶1、水质量分数0.4%、无溶剂条件下，脂肪酸甲酯收率最高达88.7%，重复使用10次后脂肪酸甲酯收率达85.5%，适合于工业化应用。李治林等［48］以硅藻土、聚氨酯树脂、氧化铝和海藻酸钠4种载体固定化米根霉细胞，其中聚氨酯树脂为适宜的载体，在80 m L液体发酵培养基中，加入聚氨酯树脂0.6 g时所制备的固定化细胞性能最佳，此时固定化细胞干质量为0.556 g，培养液酶活为17.4 U/m L;将此固定化细胞用于催化大豆油甲酯化反应，在甲醇与大豆油的质量比5∶1、甲醇分批加入(每12 h加1批)的情况下，脂肪酸甲酯收率可达94%。

1.3.3 复合脂肪酶协同催化法制备生物柴油

复合脂肪酶协同转酯化作用可解决单一脂肪酶受酰基转移速率的影响而导致转化效率低的问题。对复合脂肪酶与单一脂肪酶的催化效果进行比较研究，可探索出能有效提高脂肪酶转化效率的生物酶法新工艺。周位［49］报道，在无溶剂体系中，Novozym 435脂肪酶分别与 Lipozyme TLIM 和Lipozyme RM IM脂肪酶以质量比7∶3混合时，脂肪酸甲酯收率分别达到94.52%和96.25%，比Novozym 435脂肪酶单独使用时分别提高了9.52%和9.99%。在叔丁醇体系中，当Novozym 435与Lipozyme TLIM脂肪酶分别以质量比6∶4和8∶2混合时，脂肪酸甲酯收率分别为85.06%和81.5%，比Novozym 435脂肪酶单独使用时分别提高了9.89%和7.48%;优化叔丁醇体系中复合脂肪酶催化条件后，脂肪酸甲酯收率达92%。蒋建新等［50］研究了Novozym 435和Lipozyme TLIM混合脂肪酶催化香叶树籽油制备生物柴油，以叔丁醇为溶剂，最优反应条件为：温度38.5℃、甲醇与油的摩尔比4∶1、叔丁醇与油的体积比1∶1.5、混合脂肪酶用量为油质量的 4%，此时油脂转化率达90.09%。当两种脂肪酶按质量比1∶3混合时，具有协同催化作用，既可提高反应转化率，又可降低酶的使用成本。

2 脂肪酶法制备生物柴油的发展方向

脂肪酶法制备生物柴油已成为国内外研究者关注的热点，并已取得很多研究成果，特别是获得了许多催化活性极高的不同来源的脂肪酶，为脂肪酶法制备生物柴油的产业化进程奠定了坚实的基础。今后的研究方向应为：(1)对酶制剂的研究。利用DNA重组技术可生产重组脂肪酶，降低酶的生产成本，改变其热稳定性、脂肪酸链长度专一性、底物专一性、醇链长度专一性、醇耐受性及pH稳定性。对于已发现的催化活性高、连续生产酶活损失少的脂肪酶，还应继续降低其制造成本和使用成本，即进一步提高酶的循环利用性能。(2)原料的解决。鉴于国家产业政策不允许利用食用油生产生物柴油，应加大对非食用油脂及废弃油脂的研究应用，如餐饮废油、地沟油等的脂肪酶催化转化研究;还可加大以动物油脂为原料，使用脂肪酶法制备生物柴油的研究。(3)对脂肪酶的使用方式进行改进。脂肪酶固定化技术的成功与否是脂肪酶法合成生物柴油能否得以工业化应用的关键，获得廉价、易于活化和制备的固定化脂肪酶是今后的研究重点。

3 结语

随着石油资源的日益枯竭以及人们对环境保护的日益关注，可再生、环境友好的生物柴油已被认为是一种新的可替代石化柴油的清洁燃料，国内外已建成了各种规模的生物柴油生产厂。随着脂肪酶法合成生物柴油技术的发展与产业化进程的推进，脂肪酶法制备生物柴油将会以其高效、安全、节能、环保、低成本等优点得到广泛推广应用。

致谢 本文的完成得到云南师范大学太阳能研究所、生物能源持续开发利用教育部工程研究中心、云南省生物质能与环境生物技术重点实验室、云南省农村能源工程重点实验室以及云南师范大学生物质能创新教学团队全体成员的大力支持。

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Research Status of Biodiesel Production by Lipase Method and Its Prospect

Wang Changmei，Zhang Wudi，Chen Yubao，Yin Fang，Xu Rui，Liu Shiqing

(Solar Energy Research Institute，Yunnan Normal University，Kunm ing Yunnan 650092，China)

Lipase method for biodiesel production has the advantages of mild reaction conditions，low alcohol use level，easy glycerol recovery，no waste material production and so on.The lipase type (come from animals，plants and microorganisms)，raw oil type(vegetable oils，animal fats，algae oils and waste oils)and the lipase catalysis type(free enzyme catalysis，immobilized enzyme catalysis and composite lipase concerted catalysis)were summarized.It was pointed out that the research of enzyme preparation，sources of the raw materials for biodiesel production and the using method of the lipases would be the tendency of the research and development of biodiesel production catalyzed by lipase.

lipase;biodiesel;enzyme catalysis;transesterification

1000-8144(2011)08-0907-05

TQ 426.97

A

2011-03-15;［修改稿日期］2011-05-28。

王昌梅(1975—)，女，云南省永善县人，博士生，电话15969431782，电邮 wangcmzf@gmail.com。联系人：张无敌，电话13508714255，电邮wooti@ynnu.edu.cn。

云南省应用基础研究基金项目(2010CD050);云南省能源局“地沟油制取生物柴油装备研发及推广项目”(20102127)。

(编辑 安 静)

石油化工新材料