HMBA对人食管癌细胞核基质蛋白表达的影响

杨海波，李 昌，陈兰英，阮鹏飞，高升

(河南城建学院生物工程系，河南 平顶山 467044)

研究表明，肿瘤细胞中核基质的组成和构型与正常细胞有显著的差别［1］。2010年6月～2011年2月，我们采用环六亚甲基双乙酰胺(HMBA)诱导人食管癌EC9706细胞分化，观察了分化过程中细胞核基质蛋白表达的变化，旨在探讨食管癌细胞分化及其基因表达的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞EC9706由郑州大学基础医学院杨胜利教授赠送。HMBA购自Sigma公司，尿素、硫脲、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇、甲基磺酸盐购自上海生工公司，两性电解质购自Pharmcia公司。所有溶液均用Milli-Q水配制［2］。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 人食管癌EC9706细胞培养在内含15%热灭活小牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、50 μg/ml 卡那霉素RPMI-1640培养液中，培养液 pH 7.2 ～7.4，37 ℃恒温培养，细胞接种24 h后分为对照组和观察组，对照组换上新鲜培养液，观察组换上含5 mmol/L的HMBA作用液进行诱导处理，诱导处理5 d后收获备用［3］。

1.2.2 核基质蛋白提取 两组均加入细胞骨架提取液CSK100(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，100 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)0 ℃放置10 min，400 g 离心5 min，去除上清液。加入细胞骨架提取液CSK 50(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，50 mmol/L NaCl2，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)洗涤2次，离心，去除上清液。加入300 U/mL DNaseⅠ(CSK 50配制)消化30 min，加入1 mol/L(NH4)2SO4至终浓度 0.25 mol/L，室温沉淀15 min，1000 g离心5 min，最后 CSK 50洗1次，于－80 ℃储存备用［3，4］。

1.2.3 核基质蛋白表达检测 采用双向凝胶电泳法。①双向聚丙烯酰胺凝胶电泳:制备管胶直径2 mm，长14 cm。核基质蛋白样品加入裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，50 mmol/L DTT，2% 两性电解质，pH 3.0 ～9.5)，冰浴超声 2 min，4℃ 16000 g离心30 min，上样量100 μg，电泳600 V 16 h，1000 V 1 h，等电聚焦电泳结束后，胶条在平衡缓冲液(5%SDS，50 mmol/L DTT，10% 甘油，0.65 mmol/L Tris，pH 6.8，痕量溴酚蓝)中平衡 20 min，转移到1 mm厚13%的SDS-PAGE上部，以1%琼脂糖封闭，250 V恒压下，电泳至溴酚蓝到达凝胶的底部。进行银染，采用GDS 8000pc凝胶成像分析系统扫描，经PDQuest软件分析差异点。②图像分析:采用凝胶图像分析软件PDQuest 8.0(Bio-Rad)行蛋白点的检测、匹配、定量、标准化及统计学分析。两组细胞的核基质蛋白电泳各有三处重复，按每个蛋白点的密度相对于整张凝胶总密度的比值对各蛋白点行标准量化，消除上样量差异，选取表达水平相差2倍以上的蛋白点。

2 结果

两组双向电泳凝胶图谱的匹配率均为80%以上，分别检测到大约132个蛋白点，其中15个蛋白质点具有明显差异，两组大多数核基质蛋白分布情况相似，仅少数蛋白表达发生改变。依据分析的先后顺序对上述15个核基质蛋白点编号。其中NMP-5、8、12、13、14 仅在观察组中表达;NMP-1、2、3、4、6、7、9、10、11、15，两组均有表达，但观察组 NMP-7、11、15 表达明显减弱，NMP-1、2、3、4、6、9、10 表达则显著增强。

3 讨论

核基质是真核细胞核内的纤维网架结构，不仅对于维持细胞核形态、DNA复制、转录、RNA加工修饰、基因表达调控等方面有重要作用［5～7］，且还参与调控细胞的增殖、分化与凋亡等生命活动［8］。

本研究采用HMBA诱导人食管癌EC9706细胞分化，共发现15个差异表达的核基质蛋白。其中NMP-5、8、12、13、14 为经 HMBA 诱导处理后新出现的蛋白质，而NMP-7、11和15在EC9706细胞表达较强的蛋白诱导处理后明显减弱，提示这些蛋白的表达与EC9706细胞的增殖及其恶性程度有重要关系。NMP-1、2、3、4、6、7、9 和 10 在 EC9706 细胞中表达较弱，在HMBA处理后细胞中其表达明显增强，提示这些蛋白的出现和表达增强对于EC9706细胞的分化及其恶性表型的逆转起了重要作用。本研究证实人食管癌EC9706细胞诱导分化过程中伴有核基质蛋白表达的差异;与肿瘤细胞增殖分化相关的特异性核基质蛋白的存在，初步从分子水平印证了核基质与癌细胞分化和逆转的重要关系。进一步分离纯化和鉴定上述核基质蛋白，深入研究其在基因表达调控和细胞信号转导中的作用，对于揭示核基质蛋白与细胞癌变和逆转的关系，阐明细胞增殖分化的基因表达调控原理，均具有十分重要的意义［9，10］。

综上所述，深入研究这些在诱导分化处理过程中发生变化的核基质蛋白，不仅可为相关疾病的诊断及治疗靶点提供重要的依据，亦可为肿瘤细胞诱导分化机理的研究提供重要的切入点。

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