胆管癌组织中Survivin和Caspase-3蛋白表达及与预后的关系

许 鹏，黄 强，刘臣海，谢 放，邵 峰

(安徽医科大学附属省立医院，合肥 230001)

胆管癌是消化系统中预后很差的肿瘤，由于其特殊的解剖部位，早期不易发现，手术根治率低，目前缺乏有效的早期诊断方法。Survivin蛋白为新近发现的凋亡抑制蛋白，与肿瘤的发生、发展有关［1］，参与调控内源性和外源性凋亡路径［2］;Caspase-3为细胞凋亡通路的关键蛋白，Survivin对Caspase-3活性有抑制作用。2005年1月～2007年12月，我们检测了Survivin蛋白和Caspase-3蛋白在胆管癌和胆管癌癌旁正常胆管组织中的表达情况，探讨Survivin和Caspase-3蛋白表达与胆管癌患者的临床特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 手术切除的胆管癌标本57份(胆管癌组)及癌旁正常胆管组织23份(对照组)，所有患者术前均未做放疗、化疗等抗肿瘤治疗。57例胆管癌患者中男33例，女24例;年龄36～80岁，中位年龄59岁;组织学分型和分化程度依据2000年世界卫生组织(WHO)标准，其中高分化8例，中分化32例，低分化17例;TNM分期按1997年国际抗癌联盟(UICC)制定的标准，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期20例。

1.2 Survivin、Caspase-3 蛋白表达检测 兔抗人Survivin，Caspase-3多克隆抗体购买于美国Bioworld生物公司;过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色试剂盒(SP-9001)购买于北京中杉金桥生物技术有限公司。所有的手术标本均常规经10%甲醛固定、石蜡包埋，连续4 μm切片。组织切片于90℃烤箱中烘烤10 min，二甲苯、梯度乙醇脱蜡;3%过氧化氢5 min以消除内源性过氧化物酶活性;将载玻片浸泡于0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)中，微波修复抗原10 min;10%正常山羊血清工作液封闭;滴加稀释的兔抗人 Survivin抗体(稀释比1∶100)、Caspase-3抗体(稀释比1∶100)，4℃孵育过夜;滴加生物素化标记山羊抗兔IgG工作液37℃反应1 h;滴加辣根酶标记的链霉素卵白素工作液37℃反应1 h;然后DAB显色4 min，苏木精复染细胞核、脱水，中性树脂封片固定，观察实验结果。将已知肺癌组织阳性切片结果作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。评分标准:Survivin和 Caspase-3阳性表达主要表现为细胞质或细胞核有棕黄色或棕褐色颗粒沉淀。每张载玻片随机选用五个光学显微镜下(400×)视野，观察染色强度和阳性细胞百分率，染色强度:无染色为0分，弱染色为1分，中染色为2分，强染色为3分。阳性细胞百分率评分:＜5%为0分;5% ～24%为1分;25% ～49%为2分;50% ～75%为3分;＞75%为4分。每张载玻片由2名高级职称病理医师评分，两项评分的乘积0分为阴性，1～3分为(+)，4～6分为(++)，7～12分为(+++)。其中(+)～(+++)为Survivin和Caspase-3蛋白阳性表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的比较采用χ2检验;相关性分析运行Spearman相关性检验;运用Kaplan-Meier曲线法Long-rank检验和建立Cox比例风险模型进行生存分析。所有检验均为双侧概率检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin和Caspase-3蛋白表达 胆管癌组与对照组Survivin蛋白表达的阳性率分别为64.9%(37/57)、17.4%(4/23)，Caspase-3 的阳性率分别为 42.1%(24/57)、73.9%(17/23)，P 均 ＜ 0.05。Spearman相关性分析表明，Survivin和Caspase-3蛋白在胆管癌组织中存在负相关(r=－0.415，P=0.001)。

2.2 Survivin、Caspase-3蛋白表达与胆管癌临床病理参数的关系 见表1。

表1 Survivin、Caspase-3蛋白表达与胆管癌临床病理参数的关系

2.3 Survivin和Caspase-3蛋白表达与生存期 胆管癌组总体生存时间在3～57个月，中位生存时间26个月。Survivin阳性表达者生存时间明显短于Survivin阴性表达者 (long Rank=16.535，P=0.000)，Caspase-3阳性表达者生存时间明显长于Caspase-3 阴性表达者(long Rank=31.629，P=0.000);Cox回归模型分析表明Survivin表达是胆管癌患者预后的独立影响因子(HR=5.870，P=0.020)。

3 讨论

胆管癌近年来发病率呈上升趋势，治疗效果差，5年生存率为9% ～40%［3］。肿瘤抑制基因的失活或原癌基因的激活是肿瘤发生的重要环节。

Survivin作为凋亡抑制蛋白(IAP)的成员，有报道其参与了肿瘤的发生、发展，与肿瘤血管的生成、凋亡等密切相关［4］，在许多肿瘤均有表达，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［5］。本研究发现，Survivin蛋白在胆管癌组织中表达率明显高于癌旁正常组织，与泰兴雷等［6］报道一致。Survivin蛋白表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05)。表明Survivin表达可促进胆管癌的发生、发展，作为胆管癌恶性程度评价的指标。Survivin蛋白的作用可能通过Casepase家族抑制凋亡［7］;此外还可能通过制细胞色素C的释放在线粒体水平参与抗凋亡［8］。

在细胞凋亡调控中关键家族是Caspase家族，Caspase-3则是Caspase凋亡通路的关键蛋白［9］。本研究发现，Caspase-3在胆管癌组织中阳性表达率明显低于癌旁正常组织;Caspase-3表达与胆管癌患者的分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，胆管癌分化程度越低、TNM分期级别越高，Caspase-3表达率越低;淋巴结转移胆管癌患者中，Caspase-3表达较低。即Caspase-3表达缺失可促进胆管癌的恶性转化。

目前分析Survivn和Caspase-3蛋白表达的关系在许多肿瘤中已有相关的研究，Survivn蛋白对Caspase凋亡通路具有调控抑制作用，黄建民等［10］在喉鳞癌组织发现Survivn和Caspase-3蛋白存在负性相关，在肝癌和胃癌的研究中亦有同样发现［11，12］;研究表明 Survivn 基因通过对 Caspase-3 的调控影响细胞凋亡［13，14］。本研究发现，胆管癌组37例Survivin蛋白阳性表达中有10例Caspases-3蛋白亦为阳性，Spearman相关性分析表明Survivin和Caspase-3蛋白在胆管组织中存在负性相关，提示Survivn对Caspase-3蛋白的表达存在调控作用。具体的相关可能机制有待于通过分子生物学方法进一步探讨。

本研究发现，Survivn阳性表达者总体生存时间明显短于Survivn阴性表达者;而Caspase-3阳性表达者生存时间明显长于Caspase-3阴性表达者。证实Survivn过表达和Caspase-3低表达者预后较差。其机制可能为Survivn蛋白对肿瘤血管生长有促进作用，同时通过调控凋亡路径抑制肿瘤的细胞凋亡。Cox回归风险比例模型显示，Survivin蛋白是胆管癌患者预后的独立危险因子(HR=5.870，P=0.020)。

综上所述，Survivin蛋白高表达和Caspase-3蛋白低表达对胆管癌的发生、发展可能存在协同作用。

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