骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展*

邴爱英 宋文刚

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 亦称骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)，是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞, 在一定的诱导条件下, 可分化为多种胚层细胞[1-2]，更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能, 进行异体移植时可避免免疫排斥反应[3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。

20世纪70年代中期，Friedenstein等首次报道，骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落，并将之称为骨髓多能间充质干细胞(marrow pluripotent stromal cells)，又称BMSCs。1997年，Prockop成功分离出BMSCs，发现其具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。近年来，人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属BMSCs的培养体系，其取材部位及方式等各有不同。

1 骨髓间充质干细胞的分离与培养

BMSCS的含量很低，约占骨髓有核细胞的0.001%～0.010%左右，并且随着年龄增长递减，要利用BMSCS就必须实现BMSCS的体外分离培养和扩增。目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法，现在较为常用的分离方法主要有：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂，纯度不够高。而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞，但对细胞活性和分化能力有较大影响，而且实验条件要求高，需要骨髓量较大。目前最常用的是贴壁筛选法与密度梯度离心法相结合的方法，既可以增加分离BMSCs的纯度，又避免影响BMSCs的活性，而且操作简便，成本不高[4]。

1.1贴壁筛选法 贴壁筛选法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法，是由Friedenstein在19世纪70年代中期建立的。它是根据 BMSCs在塑料培养瓶中贴壁生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，从而达到分离、纯化BMSCs的目的。Friedenstein等的工作创建了一种体外分离和培养的简便可行的方法。至今该方法仍是一种得到广泛应用的经典途径。

1.2密度梯度离心法 梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化BMSCs的目的。Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。

1.3流式细胞仪和免疫磁珠法 常用方法为免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离BMSCS，分离细胞的纯度高。 Phinney[5]用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记；而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成BMSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。

1.4BMSCs 的培养、扩增 最常用的是LG-DMEM 培养基，含体积分数 10%～20%的胎牛血清，其中体积分数10%的胎牛血清最有利于 BMSCs的贴壁、扩增及多系潜能的维持，体积分数过高时，血清中含有大量促进细胞增殖分化的因子，容易使细胞过早出现老化。但如果BMSCS要应用于临床治疗，则BMSCS应尽量避免和胎牛血清或新生牛血清的接触，以避免污染疯牛病毒和异体蛋白增加的过敏风险。目前已有多项研究使用脐带血血清或人自体血清替代胎牛血清用于BMSCs的培养，这样既可以避免上述风险，又因此类血清中含多种细胞因子，可促进BMSCs的增殖、分化，因此为临床提供了一种安全有效的培养方法。此外，种植密度、氧体积分数及细胞因子都对 BMSCs的培养有一定影响，Lennon 等认为低密度种植有益于细胞扩增，氧体积分数低于20%有利于干细胞功能的存留，血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子亦有较强的促进增殖作用。

2 骨髓间充质干细胞的生物学特性

骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织，由基质细胞和细胞间基质构成。BMSCS主要有如下特性：①形态学特征；②具有自我复制、增殖能力；③间充质干细胞的表面抗原标记；④具有多向分化的能力。

2.1骨髓间充质干细胞的形态学特征

体外培养的BMSCS体积小，成梭形或多角形，核浆比大，多为平行排列生长或漩涡状生长，部分贴壁细胞可以快速形成集落，一些呈典型的纺锤形样的BMSCS 增殖迅速，形态均一。细胞传代后，传代细胞较原代细胞的贴壁速度快，细胞传到第3代时，细胞形态比较一致。

在光镜和相差显微镜下，BMSCS 为长梭形，类似成纤维细胞外观。透射电镜下BMSCS可表现为两种不同的形态结构类型：一种是处于相对静息状态的细胞，核较大，核质比大，胞质内细胞器少；另一种是处于相对活跃期细胞，细胞体积大于前者，核不规则，含2～3个核仁，核质比小，胞质中有丰富的细胞器。

2.2骨髓间充质干细胞自我复制、增殖能力

BMSCS在体外培养条件下生长与其它细胞一样，经历生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期。对细胞周期的研究显示，只有 10% 的BMSCS复制活跃 ，而大多数细胞处于G0/G1期，高比例的G0/G1期细胞暗示BMSCS具有高度的分化潜能[6]。BMSCS能在体外多次传代仍保留其染色体核型和端粒酶活性。Conget等对培养条件下BMSCS 的生长增殖进行了实验，发现成体BMSCS可以在体外分裂(38±4)次，并且保持纺锤形态和成骨潜能直至细胞衰竭。细胞进行冷冻复苏后培养可传代达15次，细胞的增殖分化潜能未受影响。作为组织工程种子细胞，必须携带正常且完整的遗传信息，多次传代后这些遗传信息没有改变。

2.3骨髓间充质干细胞的表面标记

与造血干细胞不同，BMSCS的表面抗原并没有确定。已有数个抗体被用来鉴定BMSCS，Stro-1 阳性细胞具有多向分化能力，但是Hung等的研究提示体外扩增的Stro-1阴性的骨髓间充质干细胞同样具有多向分化能力。单克隆抗体SH2和SH3被认为是对人BMSCS比较特异的标记，SH2抗体认为是对应于细胞表面的CD105抗原决定簇，SH3抗体对应于CD73。但是在Lee研究中，分离获得的BMSCS具有典型的自我增殖和多向分化特性，但CD105标记都为阴性。至今仍没有特异的标记物来鉴定BMSCS类细胞，比较一致的看法是，对于所分离的BMSCS进行其表面抗原检测的意义，仅仅在于判断所获得的细胞的纯度或均一性，或是初步判断其为不同于骨髓造血干细胞的一类细胞，即骨髓间充质干细胞[7]。

2.4骨髓间充质干细胞的多向分化

大量的体内外实验证明，BMSCS具有多向分化潜能，在不同的微环境下可向不同的组织细胞分化。比如，在培养基中加入适量的DXM、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸可诱导BMSCS向成骨细胞分化[8]；而加入适量的DXM、人胰岛素、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、消炎痛等可诱导BMSCS向脂肪细胞分化[9]；另外，在特定的微环境下尚可诱导BMSCS向成软骨细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、 神经细胞、肝细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等三个胚层的组织细胞分化[10-12]。但是诱导分化出的细胞在体内是否能有效的归巢到特定部位，并发挥有效的生理功能尚待更多的证据进一步研究。

3 骨髓间充质干细胞的鉴定

BMSCs的鉴定问题是目前的难点之一，其原因主要在于对BMSCs的特异性表面标记物仍存在争议。在体外BMSCs以易于贴附于塑料培养板为特征，未分化的基质细胞呈梭形或成纤维细胞形。通常采用其特征性的形态以及分化为其它基质细胞系的功能来鉴定。

国际间充质及组织干细胞委员会于2006年对人来源MSCs实验研究提出三条最低鉴定标准[13]：①在标准培养条件下，MSCs必须具备对塑料底物的贴附特性；②通过流式细胞仪检测，MSCs群体表达 CD105、CD73及CD90阳性率≥95%，且CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79a或 CD19、HLA-DR阳性率表达≤2%；③经体外诱导，MSCs 必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。比较公认的鉴定标志是BMSCs 既不表达造血细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD38，也不表达淋巴细胞表面抗原CD11a、CD11b，但表达许多粘附分子CD44、CD166、CD29等，同时表达一些基质细胞表面抗原CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)以及一些细胞因子受体IL-1R、IFN-γR、TNF-α，BMSCs表达 HLA-Ⅰ类抗原，基本不表达 HLA-Ⅱ 类抗原[14-17]。SH2和SH3为BMSCs相对特异性抗原，但其单抗来源困难，尚不能作为BMSCs常规检测指标。目前鉴定BMSCs主要依赖其形态及功能特征。

4 应用前景

骨髓间充质干细胞是一类独特的干细胞，具有非常强的自我增殖能力和分化的多潜能性，可以被诱导分化成各种间充质组织，包括骨、软骨、肌肉、神经、血管内皮等细胞。由于其多向分化的潜能，兼有易于获得，对机体损伤小及体外扩增能力强的特点，BMSCs是组织工程理想的种子细胞，具有广阔的应用前景[18-20]。骨髓间充质干细胞体外培养系统的建立有利于进一步研究其移植及分化机制，具有良好的应用前景。

体外培养的BMSCs具有多向分化潜能，如成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞等，把BMSCs植入体内不同组织内，可分化出多种不同组织细胞，表现出相应组织细胞的表型和功能，具有治疗相应组织脏器疾病潜在价值。诸多研究证实其在治疗骨软骨缺损、心脏疾病、血管疾病、神经系统疾病等方面具有重要应用价值，是目前研究最广泛的细胞之一[21-23]。

5 存在的问题

目前对骨髓间充质干细胞的认识和了解还在初步阶段, 很多实验也表明间充质干细胞具有其它细胞难以比拟的优点, 因此人们已迫不及待地把这些细胞运用于心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。但是在许多具体应用过程中还有很多问题有待研究，例如：①寻找和鉴定BMSCs所特有的细胞表面标志分子。②对间充质干细胞本身特性的研究，包括它的真正起源、如何能够快速获得纯的间充质干细胞等，尚需进一步研究。③体外诱导间充质干细胞多向分化效率不高。④间充质干细胞的相互作用，如间充质干细胞与造血干细胞间相互作用、间充质干细胞与不同成熟阶段的细胞相互作用直接对其生长、分化产生的影响等，都需要进行更深一步的研究和探索。

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