绿色荧光蛋白-CCNG2表达载体的构建及鉴定

刘 洁,钟 鸣,李自娟,朱 莉,郭 艳,任美思

(1中国医科大学实验技术中心,沈阳 110001;2中国医科大学口腔医学院)

细胞周期蛋白G2(CCNG2)是细胞周期调控的负性调节因子,可阻抑细胞周期进程,抑制细胞生长[1～3]。迄今为止,关于其功能和调控机制尚未完全阐明,本研究中我们构建了以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的CCNG2融合表达载体并进行鉴定,为进一步探讨该基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人舌鳞癌细胞Tca-8113由中国医科大学口腔医学院中心实验室提供。Marthon human adult brain cDNA文库、Gateway pENTR1A载体、pcDNA6.2TM/EmGFP-DESTGateway载体、DH5α感受态细胞、LR Clonase Kit、Lipofectamine2000、Opti-MEM购自美国Invitrogen公司;In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit购自美国Clontech公司;betaine、ΦX174/HaeⅢ、λ/HindⅢ相对分子质量Marker、KOD Plus Kit购自日本ToYoBo公司;EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶购自英国Neb公司;蛋白酶K、Wizard Plus SV Minipreps质粒纯化试剂盒购自美国Promega公司;LB培养基、氨苄青霉素购自美国Sigma公司;RPMI1640、胰蛋白酶、标准胎牛血清购自美国Gibco公司;RNAiosTM Plus RNA提取试剂、DEPC、SYBR Prime Script RT-PCR KitⅡ购自大连TaKaRa公司;实验中所有引物均由大连TaKaRa公司合成,测序分析由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人CCNG2全长cDNA克隆 以Marthon human adultbrain cDNA为模板,根据GenBank基因序列(NM_004354.2)设计引物,引物的5'端引入ECoR I和Not I酶切位点,PCR扩增人CCNG2全长开放阅读框。

1.2.2 pENTR1A-G2入门克隆构建 将获得的产物稀释100倍作为模板,设计In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit专用引物,进行大规模PCR扩增。产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离、回收、纯化后与ECoR I/NotⅠ双酶切的pENTR1A进行In-Fusion克隆。菌落PCR鉴定参照质粒提取和纯化试剂盒说明制备pENTR1A-G2质粒,ECoRⅠ/NotⅠ酶切鉴定,测序分析。

1.2.3 pcDNA6.2-EmGFP-G2表达克隆构建 利用Gateway重组技术将CCNG2 cDNA序列从pENTR1A-G2转到pcDNA 6.2-EmGFP-DEST载体,取1 μl产物转化感受态细胞,涂布含有氨苄青霉素(100 μg/m l)的LB琼脂平板,37℃培养过夜。质粒的提取和鉴定方法同前,新构建的质粒命名pcDNA6.2-EmGFP-G2。

1.2.4 pcDNA6.2-EmGFP-G2亚细胞定位 胰酶消化处于对数生长期的Tca-8113细胞,用Opti-MEN制成 1×106/m l的单细胞悬液接种于 6孔板中,24 h后待细胞长满至 85%～90%时,参照 Lipofectamine 2000的说明书进行转染4 h后,换正常培养基,继续培养24 h,DAPI染色5 min,激光共聚焦显微镜观察。实验分正常对照组、pcDNA6.2-EmGFP空质粒转染组和pcDNA6.2-EmGFP-G2转染组,正常对照组未进行转染,另外两组分别转染 pcDNA6.2-EmGFP空质粒和pcDNA 6.2-EmGFP-G2。

1.2.5 CCNG2基因mRNA表达检测 采用实时定量PCR法。提取转染后Tca-8113细胞总RNA,利用Random 6 mers和Oligo(dT)Primer反转录合成cDNA模板,MAPK为看家基因,CCNG2为目的基因,SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行定量PCR扩增。MAPK上游引物为5'-AAACATGATACTCCTGTGGTGCAGA-3',下游引物为5'-CAAGCTTTAGGTAAACCTGGTGCAA-3';CCNG2上游引物为5'-AGCTTGCAACTGCCGACTCA-3',下游引物为5'-TCGGCTAGGCATTTAGAAACCAAC-3'。反应条件95℃30 s,95℃5 s,60℃34 s,95℃15 s 40个循环,60℃1 min,95℃15 s。利用MxPro-Mx3000P v4.10 Real-Time Analysis Software进行采集和分析数据。结果分析采用 2-ΔΔCt相对定量法。

1.3 统计学方法 使用SPSS 13.0统计学软件,组间比较采用One-way ANOVA方差分析,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pENTR1A-G2入门克隆鉴定 经1%琼脂糖电泳可见到在1 078 bp左右出现一特异性条带,与预计的克隆产物大小相符。连接pENTR1A转化感受态细胞,挑取15个较大的菌落,以CCNG2-Eco-FInFu和CCNG2-Not-R-InFu为引物进行菌落PCR反应,筛选出 5个阳性菌落,扩大培养,提取质粒, ECoRⅠ和NotⅠ酶切得到1 032 bp和2 700 bp两条DNA条带,鉴定正确,经测序证实与CCNG2序列一致。

2.2 pcDNA6.2-EmGFP-G2鉴定 PCR筛选出5个阳性克隆,提取质粒后,ECoRⅠ/NotⅠ酶切得到1 032 bp和7 500 bp两条DNA条带,经测序证实CCNG2正确插入到pcDNA6.2-EmGFP载体中。

2.3 pcDNA6.2-EmGFP-G2在细胞中表达 pcDNA6.2-EmGFP空质粒转染组可见整个细胞均匀分布的绿色荧光,而正常对照组未见有荧光。pcDNA6.2-EmGFP-G2转染组的绿色荧光信号除在胞质中弥漫分布,在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区浓聚。

2.4 CCNG2 mRNA表达 与空质粒转染组相比, pcDNA6.2-EmGFP-G2转染组CCNG2mRNA表达量增加了9.47倍(P＜0.01);正常对照组和空质粒组CCNG2 mRNA表达比较差异无统计学意义。

3 讨论

CCNG2基因定位于人类染色体 4q21.1位置,全长5 489 bp,含有8个外显子,编码一个由 344氨基酸组成的蛋白,表达具有组织特异性并受细胞周期严格调控[4];DNA损伤药物、抑癌基因VHL基因产物可以诱导其非 p53依赖性表达上调[5,6],FoxO和 Hoxa-10亦参与调控其表达[7,8]。并与蛋白质磷酸脂酶2A(PP2A)关系密切,CCNG2在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,在无淋巴结转移或高分化的喉癌组织中其表达较高,而在有淋巴结转移或病理低分化的喉癌中表达下降,并可作为判断患者预后的指标之一[9]。甲状腺腺瘤和乳头状癌中 CCNG2的表达水平较正常甲状腺滤泡组织明显降低,腺瘤的表达水平明显高于腺癌[10]。口腔鳞癌组织中CCNG2表达明显降低[11]。CCNG2高表达的急性白血病患者复发率明显低于低表达者,耐药者明显低于敏感者[12]。

GFP是研究基因功能的便利工具,可与多种目的基因融合而不影响产物的空间构象和功能。荧光灵敏度高,光谱稳定性好,抗光漂白能力强。根据哺乳动物的密码子对野生型GFP氨基酸进行替代改造,获得增强型 GFP,其荧光强度大大提高,增强了作为报告基因的敏感度。pcDNA6.2TM/EmGFPDESTGateway含有的Emerald GFP(EmGFP)就是这样的增强型GFP突变体,其GFP突变位点为S65T、S72A、N149K、M153T、I167T,激发波长为487 nm,发射波长为509 nm。

In-Fusion技术是近年来新兴的一种克隆技术,具有简单、方便、高效、快捷的特点[13],本研究首先从成人脑cDNA文库中扩增出CCNG2基因ORF,使用In-Fusion技术该片段亚克隆到入门载体pENTR1A中形成入门克隆pENTR 1A-G2,经过菌落PCR、酶切和测序验证pENTR1A-G2成功构建。Gateway重组克隆技术,可实现载体在多个目的表达系统间的平行转移和基因的快速克隆,保持插入方向及阅读框不发生变化。pENTR1A中包含有attL1和attL2特异性位点,pcDNA6.2TM/EmGFPDEST载体在CMV启动子下游有两个重组位点attR1和attR2,在LR ClonaseⅡ酶介导下25℃作用1 h,attL1/attL2与attR1/attR2两特异位点间发生准确的重组反应。经菌落PCR、酶切和测序验证CCNG2基因被成功插入pcDNA6.2-EmGFP载体。瞬时转染Tca-8113细胞后观察看到胞质中弥漫分布的绿色荧光信号,经荧光定量PCR验证pcDNA 6.2-EmGFP-G2转染组CCNG2 mRNA表达量显著提高,比空质粒转染组增加了 9.47倍。表明该融合载体能在细胞中高效表达。我们还发现在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区呈现极强的绿色荧光浓聚信号,集中于某些细胞器中,在分布上具有典型的特征。Don等[4]研究认为CCNG2是一个新的中心体结合蛋白,具有核浆穿梭功能,可以调节微管的稳定性,从而影响 p53依赖性的细胞周期阻抑,我们推测该胞核部分可能与中心体或细胞骨架有关,有待进一步深入研究探讨。

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