厄洛替尼联合RNAi对人肺腺癌A549细胞凋亡及survivin表达的影响

谷 蕾，吕喜英

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

厄洛替尼是一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，用于化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌(NSCLC)的二线治疗。由于其不良反应少、耐受性好，在肺癌的治疗中日益受到关注。但由于最终几乎所有患者都会产生耐药，限制了其长期疗效［1］。厄洛替尼联合标准含铂一线化疗方案不能额外改善生存率［2］，因此，需要找寻能提高肿瘤细胞对厄洛替尼敏感性、增强厄洛替尼抗肿瘤作用的方法。survivin蛋白是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白(IAPs)。研究发现，survivin除能够抑制细胞凋亡、促进细胞增殖外，还参与肿瘤细胞的耐药［3］。2009年9月～2011年3月进行本研究，旨在探讨厄洛替尼联合survivin siRNA转染对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及对survivin基因的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 p53野生型肺癌细胞株A549由河北医科大学第四附属医院提供;survivin siRNA、control siRNA-A、siRNA转染试剂、siRNA转染培养基、鼠抗人survivin蛋白单克隆抗体、鼠抗人β-actin一抗均为Santa Cruz公司产品;羊抗鼠二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒为北京普利莱公司产品;Annexin V-EGFP购于南京凯基生物科技发展有限公司;厄洛替尼购于上海罗氏制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 将A549细胞接种在50 ml培养瓶中，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内传代培养，取指数生长期细胞进行实验。实验分为5组:空白对照组:不进行任何处理;control siRNA转染组:转染control siRNA-A(一种不针对20～25 nt siRNA设计的siRNA序列，作为特异基因转染的阴性对照);survivin siRNA转染组:转染survivin siRNA;厄洛替尼处理组:加入厄洛替尼(12.5 μmol/L);survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组:转染survivin siRNA并加入厄洛替尼。

1.2.2 细胞转染及药物处理 细胞以2×105/孔接种于6孔板中，至细胞融合约60% ～80%时，按说明书进行转染，分别用survivin siRNA及阴性对照siRNA(即control siRNA-A)转染A549细胞，同时设立未转染A549细胞为空白对照组和厄洛替尼处理组。转染后6 h换液，各组分别加入含或不含厄洛替尼(12.5 μmol/L)的10%新生牛血清的 RPMI 1640培养液，继续培养48 h。

1.2.3 流式细胞技术检测细胞凋亡 培养48 h后收集细胞，1 500 r/min离心10 min，调整细胞浓度为1×107/ml，取2×105个细胞，分别加入Annexin V-EGFP 3 μl、PI 5 μl、Buffer 400 μl，室温避光反应15 min后在流式细胞仪上检测各组细胞存活率。

1.2.4 Western blot法检测 survivin 蛋白的表达用含有PMSF的细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行蛋白质定量。取等量蛋白上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，室温封闭2 h，加入一抗(鼠抗人survivin一抗1∶100，鼠抗人 β-actin一抗1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加二抗(羊抗鼠二抗1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗膜，化学荧光法显色，暗室曝光显影。实验重复3次。图像用灰度扫描软件BandScan 4.5进行灰度分析，用survivin蛋白灰度值与β-actin灰度值比值进行统计分析。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS11.5软件进行统计分析，数据以±s表示，进行单因素方差分析及2×2析因设计的方差分析，组间比较采用q检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡检测结果 空白对照组、control siRNA转染组、厄洛替尼处理组、survivin siRNA转染组、survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组细胞凋亡率分别为(0.860 ±0.606)%、(3.763 ±1.172)%、(48.913 ±1.221)%、(22.513 ±0.975)%、(54.618±1.644)%。与空白对照组及control siRNA转染组相比，survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组及survivin siRNA+厄洛替尼处理组细胞凋亡均明显增加(P均＜0.05)，survivin siRNA转染与厄洛替尼联合作用较二者单独作用细胞凋亡更加明显(P均＜0.05)。

2.2 survivin蛋白表达结果 空白对照组、control siRNA转染组、survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组、survivin siRNA+厄洛替尼处理组的survivin蛋白灰度值/β-actin灰度值分别为0.988±0.016、0.953 ±0.025、0.687 ±0.049、0.559 ±0.054、0.405±0.029。与空白对照组及control siRNA转染组相比，survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组及survivin siRNA+厄洛替尼处理组survivin蛋白的表达均受到抑制(P均＜0.05)，survivin siRNA转染与厄洛替尼联合作用较二者单独作用对survivin蛋白表达的抑制作用更明显(P均＜0.05)，空白对照组与control siRNA转染组之间差异无统计学意义。

3 讨论

survivin蛋白是IAPs家族中分子量最小的成员，研究表明survivin蛋白在包括肺癌在内的多数恶性肿瘤细胞中高表达，而在相应正常组织中不表达。在肺癌组织中survivin高水平表达与肿瘤分级分期高、淋巴结转移、血管侵犯密切相关［4，5］。由于其表达的特异性及对细胞增殖和凋亡的双重作用，使其成为肺癌基因诊断、治疗和预后研究的理想靶目标。并且，大量研究显示survivin参与肿瘤细胞耐药机制［6，7］。厄洛替尼是属于口服的酪氨酸激酶拮抗剂，通过阻断NSCLC细胞生长、增殖过程中的某些信号转导通路而发挥其抗肿瘤作用。但是近年来的研究发现，EGFR突变与NSCLC对此类EGFRTKI的敏感性有关，限制了其临床应用，耐药的产生也限制了其长期疗效。

研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)的抗凋亡作用主要是通过诱导survivin在内皮细胞中高表达而实现的［2］。VEGF是调节血管生成最主要的生长因子之一，并且受EGFR调控。本研究发现，应用厄洛替尼处理后的A549细胞较未经处理的正常A549细胞凋亡增加，survivin蛋白的表达水平明显降低，其机制可能是厄洛替尼竞争性结合EGFR使EGFR对VEGF的调控能力降低，从而降低了VEGF导致的survivin高表达;survivin在细胞G2/M期呈高表达，应用厄洛替尼后可使癌细胞阻滞于 G1期［8］，不能进入survivin高表达的 G2/M期，从而降低survivin蛋白表达水平，促进细胞凋亡。survivin siRNA转染和厄洛替尼联合作用时较厄洛替尼单独作用对细胞凋亡的促进作用更明显，证明通过转染survivin siRNA沉默survivin的表达可增加细胞对厄洛替尼的敏感性，可能是上述作用与survivin siRNA特异性抑制survivin表达共同作用的结果。本研究还发现，survivin siRNA转染和厄洛替尼处理两种因素存在交互作用，并且表现为拮抗作用，二者的相互作用有待于进一步研究。

综上所述，本实验结果为提高厄洛替尼对NSCLC的治疗效果带来了新希望，为临床提供了新的治疗NSCLC的思路和实验依据。

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