氨甲酰化促红细胞生成素抗大鼠慢性心力衰竭的实验研究

，志禄

(1兰州大学第一临床医学院，兰州 730000;2兰州大学第一医院;3保定市第二医院)

近年许多研究表明促红细胞生成素(EPO)具有心、脑、肾、视网膜等组织器官保护作用，EPO的衍生物氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)同样具有组织保护作用，且无造血功能，因而大大降低了高血压、血栓形成等风险的发生率，但其是否具有抗慢性心力衰竭(CHF)的作用尚未见报道。2010年3～4月，我们建立大鼠CHF模型，予以CEPO干预，通过观察血流动力学、血清诱生型一氧化氮合酶(iNOS)及超氧化物歧化酶(SOD)等指标，探讨其是否具有抗CHF的作用及其可能的机制，为防治CHF提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性清洁级Wistar大鼠90只，购自兰州大学医学实验动物中心，体质量(200±20)g。室内单独分笼常规饲料喂养，自由饮用紫外线消毒自来水，给予标准照明及通风条件。

1.2 主要试剂、药品 NOS(分型)测定试剂盒、SOD测定试剂盒(南京建成科技有限公司)，盐酸异丙肾上腺素注射液(ISO，上海禾丰药业有限公司)，CEPO(Warren Pharmaceuticals公司)。

1.3 实验分组、造模及给药 随机选取12只大鼠作为对照组，剩余78只腹腔注射 ISO 5 mg/kg，1次/d，连续3 d造模［1］，对照组同期腹腔注射等量生理盐水。喂养5周后，造模大鼠死亡11只。其中腹腔注射ISO 后第1、2、3天分别死亡5、3、2只，其后喂养期间死亡1只;对照组大鼠无死亡。对存活大鼠进行造模成功判定，以左室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg提示CHF模型构建成功［2］。剔除造模失败、术中意外死亡及术后死亡大鼠，共有24只大鼠造模成功，随机再分为干预组(n=12)及心衰组(n=12)。干预组腹腔注射 CEPO 50 μg/kg［3］，2 次/周，持续4周［4］，心衰组及对照组同期腹腔注射等量生理盐水，干预4周后进行实验指标的测定。CEPO干预期间，干预组大鼠无死亡，心衰组大鼠死亡1只，死因可能为心衰加重，对照组大鼠死亡1只，经解剖检验死因为肠粘连。腹腔注射时均注意回抽，避免入血管、膀胱及肠管。

1.4 检测指标 干预4周后，于最后1次给药后禁食水12 h，称重，穿刺右侧颈总动脉，并置入内含0.1%肝素、直径1 mm、末端带有微压力传感器的聚乙烯导管，连接BL-410S生物机能实验系统，记录血流动力学指标，包括心率(HR)、LVEDP、左室内压峰值(LVSP)、左室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。血流动力学指标测定完成后，于右侧颈总动脉插管处留取血样本2 ml置于抗凝管中，室温静置15 min后，于常温下3 000 r/min离心10 min，留取上清液，置入－70℃冰箱备用。按试剂盒说明检测血清iNOS、SOD水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用一维方差分析。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况 实验全程对照组大鼠饮食正常、行动自如、毛色光泽，心衰组及干预组大鼠先后出现精神不振、活动懒散、进食减少及毛枯无泽、散乱竖起等心力衰竭症状，严重者还出现脱毛、口唇及足趾发绀、行走不稳等症状。但干预组大鼠CEPO干预后心衰症状较心衰组有所改善。

2.2 血流动力学变化 见表1。

表1 各组大鼠血流动力学指标比较(±s)

表1 各组大鼠血流动力学指标比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与心衰组比较，△P ＜0.05

组别 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)－dp/dtmax(mmHg/s)HR(次/min)对照组 11 140.91±6.83 5.14±1.11 3 963.54±178.83 －3 999.62 ±119.25 329.31 ±12.14心衰组 11 110.52 ±8.85* 20.37 ±1.34* 2 570.86 ±184.12* －3 253.47 ±196.71* 417.17 ±13.23*干预组 12 125.34 ±8.72＊△ 12.57 ±1.25＊△ 3 062.78 ±149.24＊△ －3 584.53 ±172.86＊△ 390.83 ±12.38＊△

2.3 血清iNOS及SOD水平测定 与对照组相比，心衰组及干预组血清iNOS水平显著升高(P＜0.05)，而 SOD 水平显著降低(P ＜0.05);与心衰组相比，干预组血清iNOS水平显著降低(P＜0.05)，而SOD水平显著升高(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清iNOS及SOD水平比较(U/ml，±s)

表2 各组大鼠血清iNOS及SOD水平比较(U/ml，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与心衰组比较，△P ＜0.05

组别 n iNOS SOD对照组11 8.58 ±0.91 56.80 ±2.62心衰组 11 29.73 ±0.99* 44.16 ±3.88*干预组 12 21.23±1.49＊△ 50.96±3.43＊△

3 讨论

CHF是多种心血管疾病的最终转归，严重威胁着人类的健康，预后不良，心衰的5年生存率与恶性肿瘤相仿［5］。因此，防治CHF具有非常重要的意义。CHF的病理生理改变十分复杂，其中神经内分泌紊乱和心室重塑是CHF最主要的发病机制，而心肌细胞过度凋亡引起的心肌细胞丢失及氧自由基(OFR)水平过高在CHF的发生、发展过程中起着重要的作用。其中NO除具有血管扩张效应、抗平滑肌细胞增殖、抗血小板聚集和黏附等作用外，还有细胞毒性及作为炎症介质等作用。在体和离体研究发现，低浓度NO能增加心肌收缩力，而高浓度NO则抑制心肌收缩力。NO合成的关键酶一氧化氮合成酶(NOS)分为两型，即原生型一氧化氮合成酶(cNOS)和iNOS。Saito等通过在大鼠急性心肌梗死模型中应用选择性iNOS抑制剂S-methylisothiourea(SMT)证实了iNOS在心脏结构和功能方面的负性作用［6］。cNOS主要参与抑制左室重构及左室功能异常［7］。

CHF时iNOS高度表达，而cNOS降低，NO水平明显增高，高浓度NO可损害线粒体能量代谢、抑制细胞增殖、破坏DNA结构、促进心肌细胞凋亡;另外，NO还具有细胞毒性作用，可以影响细胞代谢，干扰细胞呼吸链和酶的活性，激活使DNA降解的核酶，从而直接启动细胞凋亡，进而恶化CHF。OFR是机体内一类活泼的不稳定基团，可与细胞膜及细胞器膜的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致细胞损伤。在生理情况下OFR产生与消除处于动态平衡。这种平衡一旦被打破，过高的OFR水平将会造成细胞结构和功能的受损，进而导致机体代谢紊乱。尤其是过高的OFR还可以损伤血管内皮细胞，暴露内皮下胶原，吸引血小板黏附、集聚，并使血管舒张因子合成减少、活性减弱，造成血管过度收缩，加速CHF的进程。而SOD是体内清除OFR最主要的酶，其活力的高低间接反映机体清除OFR的能力。

本实验结果表明，CEPO可明显改善CHF大鼠血流动力学指标，升高LVSP及±dp/dtmax并降低LVEDP及HR。因此，CEPO可以改善CHF大鼠心功能。同时，CEPO干预组具有降低血清iNOS水平，升高SOD水平的作用。提示CEPO可能通过抑制过度的NO释放及清除OFR来改善CHF大鼠的心功能，从而发挥其抗CHF作用。本研究为治疗CHF提供了新的干预方法和科学依据，为开发CEPO的新用途奠定了新的理论基础。

［1］Krenek P，Kmecova J，Kucerova D，et al.Isoproterenol-induced heart failure in the rat is associated with nitric oxide-dependent functional alterations of cardiac function ［J］.Eur J Heart Fail，2009，11(2):140-146.

［2］Tonnessen T，Christensen G，Oie E，et al.Increased cardiac expression of endothelin-1 mRNA in ischemic heart failure in rats［J］.Cardiovasc Res，1997，33(3):601-610.

［3］Fiordaliso F，Chimenti S，Staszewsky L，et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemiareperfusion injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(6):2046-2051.

［4］Li Y，Takemura G，Okada H，et al.Reduction of inflammatory cytokine expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure［J］.Cardiovasc Res，2006，71(4):684-694.

［5］中华医学会心血管病分会，中华心血管病杂志编辑委员会.慢性收缩性心力衰竭治疗建议［J］.中华心血管病杂志，2002，30(1):7-23.

［6］Saito T，Hu F，Tayara L，et al.Inhibition of NOS2 prevents cardiac dysfunction in myocardial infarction and congestive heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(1):339-345.

［7］Jones SP，Greer JJ，Van Haperen R，et al.Endothelial nitric oxide synthase over expression attenuates congestive heart failure in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(8):4891-4896.