多药耐药相关蛋白-3、4基因在人胆囊胆固醇结石中表达的半定量研究

赵家锋,王建南,吴青松,黄从云,高双全,张小龙,朱剑华,黄亚丽

(广东省粤北人民医院,1.肝胆外科;2.病理科;3.血液内科,广东韶关,512026)

胆囊结石是临床上一种常见病,在我国约80%的胆囊结石为胆固醇结石[1]。胆囊结石长期存在可继发胆囊炎、胆管炎、胰腺炎以及胆道肿瘤等,严重影响人们的健康和生活。目前胆囊结石的形成机制尚未完全明了。胆汁胆固醇过饱和理论认为,病人胆汁中胆固醇过多和胆汁酸减少,造成了胆固醇在胆汁中形成过饱和,进而结晶形成结石[2]。有研究表明,胆囊结石患者胆囊上皮细胞选择性吸收胆汁胆固醇和磷脂的能力降低[3]。这使得胆汁中的脂类物质易于沉积,最终导致结石的形成。本研究欲通过对人胆囊中MRP3、MRP4基因的检测,了解其在人胆囊胆固醇结石形成中可能的作用,分析胆囊胆固醇结石形成机制,进而为胆囊结石的形成机制的研究提供证据,并为临床防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂:一步法RT-PCR试剂盒,购于宝生物工程(大连)有限公司;T RIZOL总RNA提取试剂盒,购于美国Invitrogen公司;100 bp DNA maker和DEPC,购于华美生物技术工程公司;Tris-base购自美国Promega公司;MRP3、MRP4及B-actin的PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.1.2 0.1%DEPC水的配制:在室温下(约20℃)将DEPC(焦碳酸二乙酯)2 mL溶于1 998 mL三蒸水中,经磁力搅拌器搅拌30 min使其充分溶解。

2 实验方法

2.1 标本选择

2.1.1 实验组的选择:实验组所选用的30例患胆固醇结石人胆囊组织标本,为2009年4月～2010年9月因“胆囊结石”在本院行“LC(腹腔镜胆囊切除术)”后的手术标本,所入选的病例均经实验证实为胆囊结石为胆固醇结石(方法见后述),入选者无血脂异常,无病毒性肝炎病史等其他合并症;不伴有肝内胆管及胆总管结石。入选病经手术切除胆囊后,于无菌条件下用灭菌的生理盐水清洗胆囊标本后,立即置于液氮冷冻,并及时转入-70℃低温冰箱保存。

2.1.2 胆囊胆固醇结石的鉴定方法:将手术所得到的胆囊结石标本在室温下风干,研成粉末状,取粟粒大小的胆结石粉末置于凹瓷板中,先加入醋酸酐5～6滴,再加入浓硫酸1滴。如溶液呈翠绿色,则为胆固醇结石。呈红星芒以胆结石粉末为中心向四周放射者,为胆色素结石则排除在实验之外。

2.1.3 对照组的选择:对照组8例无结石人胆囊标本来源于2009年5月～2009年9月在中山大学附属三院肝移植中心行肝脏移植手术中供体的胆囊,这些病例术前经各项实验室检查确定无血脂异常,无病毒性肝炎病史等其他合并症;亦无肝内外胆管及胆囊结石。

2.2 提取总RNA

按Trizol试剂盒说明书要求对所有标本组织进行总RNA抽提。RNA样品用752紫外分光光度计法测定D260nm和D280nm(D260nm/D280nm≥1.8),计算所得到的 RNA样品的浓度和纯度。所用器材均予灭活RNA酶处理。

2.3 RT-PCR检测MRP3、MRP4 mRNA 的表达

2.3.1 引物的设计与合成:MRP3的引物设计参照文献[4],并经基因库核对证实;内参MRP4与beta actin的引物的设计是通过网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov进入Genbank数据库,查找人的MRP4和beta actin基因的mRNA的全基因序列,根据其序列应用Primer premier5.0软件进行引物设计;引物合成委托上海生物工程公司完成,引物序列为:

①MRP3(扩增产物长度452bp)

forward:5′-GGGACCCTGCGCATGAACCTG-3′

reverse:5′-GGCAAGTCCAGCATCTCTGG-3′

②MRP4(扩增产物长度305bp)

forward:5′-ACGGATGAGGAACTGTGGAAT-3′

reverse:5′-TTGTCGCTGTCAATAATGGTG-3′

③beta actin(扩增产物 174bp,内参照)

forward:5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′

reverse:5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′

2.3.2 RT-PCR:按照宝生物公司的 RTPCR一步法检测试剂盒说明书(批号DRR024A)操作(本实验中将MRP3与MRP4分两个体系进行,以免引物间相互影响)。

2.3.3 电泳和图像分析:取PCR产物,于2%琼脂糖凝胶上(含0.5 μ g/mL EB)进行电泳,经凝胶成像系统观察结果并拍照。图片经扫描仪扫描后,用凝胶成像系统自带的Sigma Scan Pro 5图像分析软件进行光密度积分值分析,分别计算各标本的 MRP3、MRP4各自与 beta actin(内参物)的光密度积分值之比 ,以此作为MRP3或MRP4表达的相对含量值。

2.4 统计学处理

本实验所得数据为目的基因扩增后电泳条带的灰度值与内参beta actin灰度值的比值,为计量资料,使用SPSS 13.0统计软件进行统计描述,检验水准α=0.05。当总体方差齐同时用t-test进行统计学分析;当方差不齐时,选用Satterthwaite法分析。样本均数之间的统计分析用 t检验,检验水准α=0.05。

3 结 果

本实验结果表明,在正常胆囊组织中,仅有MRP3表达,而未能检测到MRP4表达。MRP3和MRP4在患胆固醇结石的胆囊组织中同时表达,而且表达水平均显著高于正常胆囊(P<0.001),且MRP3的表达水平显著高于MRP4(P<0.001)。

3.1 实验组与对照组MRP3表达的比较

经凝胶成像系统自带的灰度分析系统进行灰度分析,所得数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析(t-test),MRP3条带的灰度强于对照组MRP3条带的灰度(P<0.001)。

3.2 实验组与对照组MRP4表达的比较

经凝胶成像系统自带的灰度分析系统进行灰度分析,在患有胆固醇结石的胆囊标本中检测到MRP4的表达。因在正常胆囊中未检测到MRP4基因的表达,故将所得到的MRP4的灰度(相对内参)值与0进行统计学对比,差异有显著统计学意义(P<0.001)。

3 实验组胆囊组织中MRP3和MRP4的表达情况

经凝胶成像系统进行灰度分析,MRP3条带的灰度强于MRP4的灰度。将所得的灰度值经SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析显示,两者的差异具有显著的统计学意义(P<0.001)。

4 讨 论

MRP家族有9个成员(MRP1-9)[5-7],属于ABC转运家族的一个亚族[8]。已知MRP家族中的成员可以转运不同的底物,包括各种抗肿瘤药物、硫酸盐、葡萄糖醛酸苷、或者谷光苷肽等到的化合物,以及环肽、一磷酸核苷酸、环核苷酸等[9]。

已有研究发现,正常情况下在肝细胞和胆管细胞的基底外侧膜有MRP3表达[10-11],其功能可能是在介导有机阴离子从肝内排泌入血液[5]。它可以转运单价(如牛磺酸和甘氨酸胆酸盐)和二价的胆汁酸盐(例如牛磺石胆酸的硫酸盐和牛磺鹅脱氧胆酸的硫酸盐)以及葡萄糖醛酸苷的化合物[12-13]。在胆汁淤积和高胆红素血症(结合与非结合胆红素升高)时其表达可以上调[14]。

有研究表明,MRP4的底物亦较为广泛,可以运载硫酸类固醇和胆汁酸的硫酸盐[15],还可以转运环核苷酸和核苷酸类似物[16-17]。有研究指出,正常情况下的肝脏,MRP4表达量较低[18]。然而提高肝细胞的胆汁酸盐浓度可以使MRP4在肝内的表达上调[19]。提示Mrp4在对有毒的胆汁酸的化合物的排泌过程中发挥作用。

在ABC转运体家族中的MRP亚家族中,MRP4是独一无二的双重定位,即它可以随不同的组织和细胞而出现不同的表达定位。MRP4既可定位于细胞顶端膜,在这些地方它将底物定向地向管腔内转运。亦可定位于基底外侧膜,以阻止底物从管腔内向外转运。推测MRP4在极性细胞的这种定位可能对一些独特而重要的阴离子底物的转运中发挥作用[20]。

关于MRP3、MRP4在胆囊胆固醇结石形成过程中的具体作用,作者认为,在胆囊上皮组织中,MRP3定位于上皮细胞的基底外侧膜,其作用是将胆汁中的胆酸盐重吸收而排泌入胆管和胆囊周围的血管丛。而对于MRP4而言,可能它既在胆囊上皮的顶端表达同时也在胆囊皮细胞的的基底外侧膜表达,在这些不同的部位,发挥不同的作用:在顶端膜,它可能是将胆固醇排泌入胆囊内的胆汁;而在基底外侧膜,它却将胆酸盐排向血液。这两方面的作用将导致胆汁中胆固醇的浓度升高,同时胆汁酸盐的浓度却降低,其最终结果将使胆汁中的胆固醇易于结晶,进而促进胆固醇结石的形成。

综上所述,作者认为MRP3、MRP4在胆囊胆固醇结石患者的胆囊组织中同时表达,并且表达水平较无结石患者均升高,因而认为它们共同导致胆囊内已经浓缩的胆汁中的胆酸盐浓度进一步降低,同时却使得胆固醇的浓度进一步升高,进而认为MRP3、MRP4在胆汁酸盐的排泌中起重要作用,与胆囊胆固醇结石的形成有关,即促进胆囊胆固醇结石的形成。

(致谢:衷心感谢中山大学附属第三医院肝移植中心为本研究提供的对照组标本及在此过程中提供的帮助)

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