流式细胞术在蔬菜倍性鉴定中的应用

成 妍，马蓉丽，焦彦生，吴海涛

（山西省农业科学院蔬菜研究所，山西太原030032）

蔬菜作物倍性鉴定在遗传育种中具有十分重要的作用。通过花药（小孢子）、未受精子房再生出的植株，一般是倍性水平不同的混合群体，进行有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。倍性鉴定可用来检测三倍体无籽西瓜、甜瓜的种子纯度。另外，倍性鉴定也可用于细胞分裂等生理活动分析和遗传效应研究。蔬菜作物传统的倍性鉴定方法有田间植株性状调查法、花粉母细胞染色体计数法、根尖染色体计数法、花粉粒大小判别法和气孔保卫细胞叶绿体计数法等。

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）倍性鉴定是20世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具的倍性鉴定方法。流式细胞仪能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、蛋白质、RNA、抗原等，并可对其分类、收集。FCM借鉴了荧光显微镜技术，同时利用了计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展，将荧光显微镜的激发光源改为激光，使之具有更好的单色性与激发效率，大大提高了检测灵敏度。同时，将固定的标本台改为流动的单细胞悬液，用计算机进行数据处理，大大提高了检测速度与统计精确性，而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数，被誉为是细胞分析领域的“CT”[1-2]。

目前，该技术已广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学研究领域，但在蔬菜遗传育种工作中的应用还很少。全面、系统地了解流式细胞术是十分必要的，因此，笔者对它的原理、操作步骤、优缺点及其在蔬菜作物倍性鉴定中的应用进展进行了综述。

1 流式细胞术倍性鉴定的原理

DNA荧光试剂可定量结合在DNA双链的碳架结构上，细胞核内DNA分子数目越多，DNA分子链越长，荧光试剂嵌入碳架结构中的量就越多，经激光照射，这些DNA猝发荧光的强度也就越强。因此，在同一条件下，经荧光试剂处理的细胞核DNA所发荧光强度的强弱，反映了细胞核DNA含量的高低[3]。

常用的荧光试剂有PI（碘化丙碇）、PE（藻红蛋白）、FITC（异硫氰酸荧光素）、PerCP（多甲藻 -叶绿素）和CY5（花青苷）等。

样本的细胞群体被分散染色后，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列，以1个细胞/（m·s）的速度（1 000万细胞/h）由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区时，在入射的激光束垂直照射下产生散射光和激发荧光，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把测量到的各种信号进行处理，将分析结果可显示在计算机屏幕上，也可以打印出来或以数据文件的形式存储在硬盘上，以备日后的查询或进一步分析[4]。

2 流式细胞术倍性鉴定的步骤

2.1 样品制备

将新鲜材料置于含有对DNA特异性的荧光试剂DAPI或PI缓冲液内，用解剖刀切碎（也可以研磨或剪碎），悬浮液经20～40 μm尼龙网过滤，调整细胞核密度至10万～30万个/mL。

2.2 仪器调试

打开电源，对系统进行预热；打开气体阀，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；利用标准样品（通常为鸡血红细胞）进行校准，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0°和90°散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小。

2.3 上样测定

选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；选择计算机屏上数据的显示方式，直观掌握测量进程。样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统。因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此，可关闭气体测量装置，单独使用计算机进行数据处理。

2.4 结果分析

由于DNA含量与荧光信号强度呈正比关系，细胞核的倍性最后以C或n值表示，所以，1C表示细胞核单倍体，2C表示细胞核二倍体，依此类推。

3 流式细胞术倍性鉴定的优缺点

流式细胞术倍性鉴定可以在短时间内高速分析上万个细胞，同时对许多样本的大量细胞核DNA含量进行测定，DNA含量变异可在分布图上直观地看出。与传统的荧光镜、电子显微镜检查相比，其具有速度快、分辨率高、数据可重复性好、准确性高，制样简单，试材用量很少（50 mg左右），不影响植物正常生长等优点，这对于经细胞融合获得的多倍体细胞团块的早期鉴定具有更大的应用价值；采用染色体计数只能对少量细胞进行统计分析，无法全面判断嵌合体的倍性水平，而应用流式细胞术倍性鉴定结果更准确。

其缺点是：目前国际上还没有一个统一的测量植物核DNA含量的标准作为参照，使用不同的内标进行DNA绝对含量测定，结果存在误差；使用不同的核荧光染料检测，结果也有明显的差异；检测费用较大，一般育种单位难以承受。

4 流式细胞术在蔬菜作物倍性鉴定中的应用

Cao等[5]利用流式细胞仪（Partec CAII CHEM UNEX）鉴定2个小白菜品种的游离小孢子培养再生植株的倍性，表明2个群体均有自然加倍单倍体存在，但不同品种的小孢子植株中单倍体比率不同。周元昌等[6]采用德国Partec GmbH公司生产的流式细胞仪以抱子甘蓝的花培苗群体为材料，采用DNA流式细胞仪测定法和形态学鉴定法鉴定其倍性组成，结果表明，DNA流式细胞仪测定法可鉴别群体的各种倍性水平，而形态学鉴别法可把群体中的二倍体与单倍体、四倍体及其他多倍体分开。

顾宏辉等[7]用德国Partec GmbH公司生产的流式细胞仪鉴定早熟菜苔品种油青四九小孢子再生植株的染色体倍性，结果表明，油青四九再生植株中单倍体比率为14%，自发二倍体的比率达到70%，四倍体比率为8%，以及少量的（不到8%）其他多倍体（如三倍体、六倍体）和混倍体（如单倍体加二倍体、二倍体加四倍体）。Gu等[8]对小白菜和乌塌菜的小孢子后代进行流式细胞仪倍性分析表明，70%以上的再生植株发生了自然加倍，其中包括自然加倍的四倍体。

陈斌等[9]采用FACSCalibur流式细胞仪，应用Mod Fit分析软件对7个甜椒F1和3个辣椒F1的花药培养的再生株在幼苗期进行了倍性鉴定。流式细胞仪的矩形图中清楚显示出每份材料叶片的DNA含量，即检测出单倍体、二倍体、三倍体或单倍体加二倍体的混倍体。研究表明，流式细胞仪可快速准确地检测出试材的染色体倍性，并与坐果结子的鉴别结果相一致。韩阳等[10]用德国Partec GmbH公司生产的DNA流式细胞仪对大白菜小孢子植株群体的倍性变异进行观察，并以染色体计数法的鉴定结果为依据进行研究，结果表明，DNA流式细胞仪鉴定法的准确率94.44%，可用于大白菜小孢子群体倍性鉴定。

韩毅科等[11]用FACSCalibur流式细胞仪对经抗微管除草剂胺磺灵加倍处理过的黄瓜进行倍性鉴定，研究表明，与染色体计数法相比，用流式细胞测定法能迅速测定黄瓜叶片单个细胞核内DNA含量，根据含量的峰值能准确推断细胞的倍性，且流式细胞术特别适合离体培养的小植株进行倍性鉴定。张振超等[12]利用美国Beckman公司的流式细胞仪测定经秋水仙素处理过的不结球白菜倍性，以普通二倍体材料作为对照，对照的DNA相对含量为100，疑似株的DNA为200，表明其是四倍体；疑似株有2个值，与对照的比值约为1和2，表明其是嵌合体（2x＋4x）。流式细胞仪鉴定结果与染色体计数法鉴定结果一致，表明流式细胞仪可较准确地检测不结球白菜突变株的倍性。马丽华等[13]利用FACSCalibur流式细胞仪，通过自动分析、检测细胞DNA含量的分离峰，来鉴定不结球白菜小孢子再生植株的染色体倍性，研究发现，不结球白菜自然加倍率很高，且倍性变异情况比较复杂，其中，四倍体植株占比例最高，达到56.39%；二倍体植株占39.10%；三倍体植株占3.01%；而单倍体植株仅占1.50%。

成妍等[14]采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics XL型流式细胞仪测定不结球白菜小孢子再生植株的DNA含量，以普通二倍体材料作为对照，结果表明，不结球白菜小孢子再生植株自然加倍率总体水平较高，有的高达90%，但不同基因型间有明显差异。邓耀华等[15]先利用流式细胞仪对甘蓝小孢子植株进行倍性鉴定，以此作为依据，再利用普通光学显微镜观察已通过倍性鉴定的双单倍体与单倍体的气孔保卫细胞，测定其大小与叶绿体数，研究表明，气孔保卫细胞叶绿体数是鉴定甘蓝小孢子植株倍性的简易有效手段。

方淑桂等[16]采用德国Partec GmbH公司生产的PA-I流式细胞仪对不同熟性的大白菜小孢子植株群体的倍性变异进行测定，结果表明，小孢子植株是倍性水平不同的混合群体，不同熟性的大白菜小孢子植株群体的倍性分布不同，中晚熟大白菜小孢子植株双单倍体比例最高，春大白菜最低。周志国等[17]使用德国Partec GmbH公司的流式细胞仪对萝卜游离小孢子再生植株的叶片和茎等进行了测定，发现小孢子诱导出的植株中同时出现了单倍体、双单倍体、四倍体植株。与父母本相比，单倍体的峰值出现在75附近，二倍体的峰值出现在150附近，四倍体峰值出现在300附近。施先锋等[18]采用德国Partec GmbH公司的PA-I流式细胞仪对西瓜倍性进行早期鉴定，结果显示，二倍体植株主峰荧光强度位于50 AU，而四倍体主峰荧光强度位于100 AU，说明四倍体植株细胞DNA含量为二倍体的2倍。

5 展望

迄今，流式细胞术已应用于多种蔬菜作物倍性鉴定，与其他传统鉴定方法相比具有不可替代的优势，流式细胞术被认为是最有前途的倍性鉴定方法。随着相关研究的不断深入，这项技术将会越来越完善，应用会更加方便、快捷，检测结果会更加准确。

［1］陶抵辉，李小红，王利群，等.植物染色体倍性鉴定方法研究进展[J].生命科学研究，2009，13（5）：453-458.

［2］魏爱民，杜胜利，韩毅科，等.植物细胞染色体倍性鉴定方法[J].天津农业科学，2001，7（2）：41-43.

［3］朱道圩，杨宵，理莎莎，等.流式细胞仪在果树作物倍性鉴定上的应用[J].安徽农业科学，2006，34（24）：6480-6482.

［4］吴雅琴，常瑞丰，程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报，2006，21（4）：407-414.

［5］Cao MQ，Li Y，Liu F，et al.Embryogenesis and plant regeneration ofpakchoi（Brassica rapa L.ssp.chinensis）via in vitro isolated microspore culture [J].Plant Cell Reports，1994，13：447-450.

［6］周元昌，KennedyS.抱子甘蓝花培苗倍性的快速鉴定 [J].福建农林大学学报，2002，31（1）：55-58.

［7］顾宏辉，朱金庆，张国庆，等.菜苔小孢子培养及再生植株的倍性鉴定[J].农业生物技术学报，2003，11（6）：572-576.

［8］ Gu H H，Zhou W J，Hagberg P.High frequency spontaneous production of doubled haploid plants in microspore culture of Brassica rapa L.ssp.chinensis[J].Euphytica，2003，134：239-245.

［9］陈斌，耿三省，张晓芬，等.辣椒花药培养再生植株染色体倍数检测研究[J].辣椒杂志，2005（4）：28-30.

［10］韩阳，叶雪凌，冯辉.大白菜小孢子植株的倍性变异及倍性鉴定方法的研究[J].中国蔬菜，2006（11）：9-11.

［11］韩毅科，杜胜利，张桂华，等.利用抗微管除草剂胺磺灵诱导黄瓜四倍体[J].华北农学报，2006，21（4）：27-30.

［12］张振超，张蜀宁，张伟，等.四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定[J].西北植物学报，2007，27（1）：28-32.

［13］马丽华，沈火林，王娟娟，等.不结球白菜小孢子胚成苗及倍性变异研究[J].华北农学报，2007，22（增刊）：200-203.

［14］成妍，班青宇，王倩，等.不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定 [J].南京农业大学学报，2009，32（2）：25-29.

［15］邓耀华，熊艺，周国林，等.甘蓝小孢子植株倍性简易鉴定方法研究[J].中国蔬菜，2009（18）：46-50.

［16］方淑桂，陈文辉，曾小玲，等.不同熟性大白菜小孢子植株倍性变异及倍性鉴定方法[J].福建农业学报，2009，24（4）：304-307.

［17］周志国，王聪艳，龚义勤，等.萝卜小孢子植株倍性鉴定研究[J].江苏农业科学，2009（4）：156-158.

［18］施先锋，彭金光，李煜华，等.西瓜多倍体鉴定方法的研究[J].浙江农业科学，2010（2）：273-275.