肺癌的表观遗传学研究进展

郭晓静综述 王玉明 段 勇审校

肺癌是严重威胁人类健康的肿瘤之一，死亡率居肿瘤死亡率之首，我国肺癌发病率及死亡率均居肿瘤之首［1］。

与肺癌形成有关的遗传学机制主要包含2种［2］，其一是DNA分子核苷酸序列的异常改变造成的基因突变即传统的遗传学机制;另外是表观遗传学 (epigenetics)机制。相比传统遗传学信息表观遗传学可提供更高层次的遗传学信息。现就表观遗传学在肺癌中的研究作一综述。

1 DNA甲基化与肺癌

1.1 DNA甲基化

哺乳动物DNA甲基化(DNA methylation)［3］是指在DNA甲基转移酶(DNA methyl transferase，DNMT)催化下，由 S－腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的5＇－末端，形成mCpG的过程。DNA甲基化是真核生物体内普遍存在的1种基因内源性修饰。富含CpG序列的区域称为 CpG 岛，长200～1000 bp，常位于5＇－末端，是 DNA 甲基化发生的高频区域，有70%～80%可呈现甲基化。在正常生理情况下，该区域因胚胎早期的特异性去甲基化而处于非甲基化状态。CpG岛受到各种有害因素影响时，容易发生甲基化，从而导致基因沉默。在哺乳动物细胞中，CpG以2种形式存在，一种为分散于DNA中;另一种是CpG高度集中在一起，也称CpG岛。虽然CpG岛只占基因组DNA的1%，但存在于所有管家基因的5’端调控区，经常覆盖基因转录的启动子及第1个外显子区。哺乳动物基因组中5－甲基胞嘧啶的含量约占总胞嘧啶的3%，并集中在二核苷酸胞嘧啶结构中。

发生异常甲基化的基因与甲基化结合蛋白(如MeCP1、MeCP2)及相关因子(如组蛋白去乙酰化酶HDAC)结合，造成染色质重塑和转录关闭使抑癌基因去表达。甲基化在肿瘤的形成过程中有2个方面的作用:①甲基胞嘧啶可以使脱氨基转化成胸腺嘧啶，造成C－T突变，导致某些基因突变而失活;②抑癌基因甲基化引起相应基因沉默，表达缺失。它们都导致抑癌基因失活，引起肿瘤生长［4］。

DNMT在DNA初始甲基化及甲基化的维持中发挥着重要作用。DNMT家族至少包括 DNMT1，DNMT2，DNMT3a和 DNMT3b 4个成员。DNMT1最先被克隆和鉴定，定位于染色体19p12－13。在DNA复制时，DNMT1能够通过其N端结构域与增殖细胞核抗原(proliferating Cell nuclear antigen，PCNA)结合，并被PCNA靶向定位于新合成的DNA链上。DNMT1因维系着新合成子链的甲基化，起着维持甲基化的作用，故显得尤其重要［5］。DNMT2因缺乏DNMT1和 DNMT3的 N端调节区，故认为DNMT2不具备催化CpG位点甲基化的作用，其功能还不清楚。DNMT3亚家族包括DNMT3a和DNMT3b 2个成员，其基因分别定位于2p23和20q11.2，基因敲除实验表明DNMT3对于小鼠胚胎植入后的基因组从头甲基化是必需的。DNMT3b的1个重要功能是负责染色体着丝粒附近区域微卫星序列的甲基化;DNMT3a可能对非CpG序列，如CpA、CpT进行甲基化。DNMT活性增强是导致抑癌基因发生甲基化的重要因素之一。在不同肿瘤细胞中，不仅有DNMT1参与的甲基化维持过程，也有DNMT3b催化的从头甲基化。大多数肿瘤细胞的DNMT表达水平明显高于正常细胞，并与抑癌基因启动子高甲基化状态相关［6］。

肿瘤组织中存在基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化现象，由此引起原癌基因及促进细胞生长基因激活、抑癌基因及错配修复基因失活以及染色体不稳定等，导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生、发展。

1.2 DNA低甲基化与肺癌

大量研究证据显示，人类肿瘤发生、发展常与DNA异常甲基化有关，与正常对照组织比较，肿瘤组织中基因呈低甲基化状态［7］。基因组DNA低甲基化可以通过改变染色体结构引起基因组的不稳定，导致染色体凝聚程度降低，并造成DNA修复蛋白不易识别、接近该DNA。Wilson等［8］在对非小细胞肺癌细胞株的研究中发现1q21－q23区域中的 Bcl－2家族抗凋亡成员MCL－1出现高表达，并证实1q21－q23区域的低甲基化可能是导致MCL－1过度表达的原因，说明原癌基因的低甲基化参与肺癌的形成过程。

1.3 抑癌基因的高甲基化与肺癌

在肺癌发生过程中，基因启动子区CpG岛发生异常甲基化是1种常见现象［9］。目前已从肺癌肿瘤组织标本、细胞系、支气管上皮标本、痰液标本及血液标本检测到多种基因发生了甲基化。抑癌基因的启动子CpG岛的高甲基化是目前肿瘤表观修饰研究的热点，下面就几种肺癌中研究较多的抑癌基因进行说明。

1.3.1 p16基因 P16基因又称多肿瘤抑制基因(MTS1)，是人类肿瘤中最常见的抑癌基因，是细胞周期蛋白激酶抑制剂。人p16基因定位于9p21，全长815 kb，其基因产物为 p16INK4a和p19ARF。p16在多种肿瘤中表达失活，以基因突变、启动子区甲基化或纯合缺失为主要失活方式，发生在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)中p16启动子甲基化频繁发生。国内党伟等［10］研究肺癌患者p16基因甲基化率为24.14%(14/58)，而对照组没有发现甲基化。其中，p16蛋白阳性者甲基化率为7.4%，而p16蛋白阴性者中甲基化率为38.7%，差异有显著性(χ2=7.72，P=0.006)。结论:p16 基因外显子 E1 及调控序列HapII位点异常甲基化，可抑制p16蛋白表达，这可能是p16基因功能丧失的1个重要机制，并可能对肺癌发生起促进作用。Kim等［11］采用甲基化特异性PCR(MSP)技术对335例非小细胞肺癌(NSCLC)组织标本的p16等5个基因甲基化状况进行检测，发现p16甲基化发生率为35%;并回顾性分析NSCLC患者复发率与生存率之间的关系，分析结果为p16基因甲基化使NSCLCⅠ期患者肿瘤复发的风险增加，同时使手术后的生存率降低。此项研究说明，p16甲基化是评估NSCLCⅠ期患者复发的有价值的生物肿瘤标记物。

1.3.2 MGMT O6－甲基鸟嘌啉－DNA－甲基转移酶(O6－methylguanine DNA methyltranse，MGMT)是1种高效 DNA直接修复酶，能修复DNA序列中6－氧－甲基鸟嘌啉损伤，是人类细胞中迄今发现的唯一1种修复该损伤的甲基转移酶，对维持基因组稳定性有重要意义。MGMT在肺癌发生、诊断和治疗中具有重要意义。从107例非小细胞肺癌切除标本和相应的正常肺组织标本中检测DNA，在肺癌组织中21%的MGMT发生甲基化［12］。

1.3.3 CDH1 CDH1是1个介导细胞间黏附的基因，位于染色体16q221，其编码的蛋白 E－cadherin(E－cad)是一跨膜糖蛋白，介导ca2+依赖的同型细胞间黏附以确保上皮细胞正常表型的维持。CDH1表达程度与NSCLC临床分期呈负相关，表达下调有利于肿瘤侵袭与转移;CDH1甲基化伴E－cad蛋白表达减少的NSCLC患者比CDH1未甲基化和E－Cad蛋白表达阳性者预后差，提示CDH1基因甲基化与NSCLC患者预后关系密切。国内杨兰辉等［13］应用半定量荧光MSP检测50例肺癌患者的癌、癌旁和远癌肺组织及5例非肺癌对照肺组织标本中的CDH1甲基化的相对比值，研究认为CDH1基因甲基化水平与肺癌存在相关性，与肺癌的组织类型无相关性。说明CDH1异常甲基化和E－cad表达的减弱和缺失可能是肺癌发生和发展过程中的重要因素。国外研究者在肺癌的癌组织中发现该基因的甲基化率在43% ～50%之间［14，15］，甲基化水平高于国内研究结果。

1.3.4 RASSF1A Ras 相关区域家族 1A(Ras association domain family 1A，RASSF1A)是2000年发现的新型候选抑癌基因，位于3p21.3。RASSF1A基因全长1873 bp，是Ras凋亡家族成员，包含2个启动子和6个外显子，在其启动子区域存在16个CpG位点。RASSF1A作为1种肿瘤抑制基因，参与Ras/RASSFl/ERK通路的信号传导，通过抑制Ras激活生长效应信号的传导途径，使其丧失抑制生长、促进凋亡和衰老的功能而发挥抑制肿瘤发生的作用［16］。研究表明，启动子区域CpG岛的异常甲基化是导致RASSF1A失活的主要机制，是肺癌发生的早期事件，也是肺癌的发展步骤之一。国内学者张卉等［17］研究的150例NSCLC中58例发现RASSF1A启动子存在甲基化(38.7%)，34例癌旁正常组织和20例肺部良性病变无1例发现RASSF1A启动子甲基化。RASSF1A启动子甲基化与年龄、性别、吸烟指数、组织类型、TNM临床分期均无关(P＞0.05)，与开始吸烟年龄、肿瘤分化程度相关，表明RASSF1A启动子甲基化状态可以作为NSCLC诊断的1个候选分子标志。Tomizawa等［18］对110个临床Ⅰ期肺腺癌进行筛选，有35例(32%)发生了甲基化，经研究发现RASSF1A甲基化多出现在低分化肿瘤细胞中，并且多出现在血管侵袭和胸膜侵袭处，RASSF1A甲基化患者比非甲基化患者预后差。

1.3.5 FHIT 脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)基因是目前公认的肿瘤抑制基因，与肺癌的发生发展密切相关，其甲基化所导致的蛋白表达异常是肿瘤发生危险程度的1种标志，位于人染色体3p14.2区域FRA3B脆性位点，编码系列含组氨酸三联体;FHIT蛋白由147个氨基酸组成，定位于细胞质，是1种典型的二腺苷三磷酸水解酶。FHIT基因的异常表达主要表现在等位基因缺失(LOH)、启动子高甲基化导致胚胎期基因沉默等，但仅仅只有杂合性缺失并不完全抑制FHIT蛋白表达。启动子区CpG岛甲基化在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色。国内杨志慧等［19］研究认为FHIT基因异常甲基化在肺癌组织中的发生率明显高于癌旁组织，两者差异存在统计学意义(68.3%，35.0%，P ＜0.001);FHIT 基因甲基化的发生率在FHIT蛋白阴性患者中高于阳性表达者(83.3%vs 53.5%，P＜0.05);FHIT蛋白表达及基因甲基化发生率均与性别、年龄、吸烟状况、组织学类型、大体分型、TNM分期及淋巴结转移无关，是影响无瘤生存时间的危险因素，与Liopoulos等［20］的研究结果相一致。

1.4 DNA甲基化与肺癌的治疗

基因的甲基化可以通过甲基化药物逆转，从而抑制肿瘤细胞生长，甲基化的基因经去甲基化药物5－氮杂胞苷处理后可以重新表达。这种药物可以诱导细胞重新表达。

1.4.1 腺苷类DNA甲基化转移酶抑制剂 包括5－氮杂胞苷及其同源物5－氮－2，脱氧胞苷，具有细胞毒性，还可诱导低甲基化。其在DNA复制过程中与DNA结合，然后与DNMT通过共价键形成稳定的中间体，而使DNMT被俘获并失活，导致DNA的去甲基化和不表达基因的重新表达，一旦停用5－氮杂胞苷和5－氮－2，－脱氧胞苷，异常的基因启动子过甲基化和基因沉默再次出现。骨髓抑制等不良反应限制了它们的使用。目前该类药物更多用于血液系统肿瘤(如骨髓增生异常综合征)的治疗。其对肺癌的疗效尚有待于临床试验的证实［21］。

1.4.2 非腺苷类DNA甲基化转移酶抑制剂 该类药物直接抑制DNMT的活性，不与DNMT形成共价复合物，因此毒性较低。此类药物为近年来研发，包括EGCG(绿茶的主要多酚化合物)、RG108(1种经软件筛选的小分子的甲基化转移酶抑制物)、普鲁卡因和MG98(1种反义寡核苷酸)等［21］。这类药物抑制DNMT的化学活性，导致CpG岛去甲基化。结肠、食管、前列腺的细胞系研究都已经证明EGCG能够使甲基化导致的基因沉默重新激活。在肺癌细胞中，能否有同样的作用可以进一步研究［22］。

2 组蛋白修饰与肺癌

组蛋白的修饰比DNA甲基化复杂的多，因为不同的组蛋白(H3和H4)的不同氨基酸(H3末端有7个 Lys和2个 Ser，H4末端有5个Lys和1个Ser)可以发生不同类型的修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，他们都是组蛋白密码的基本元素［23］。在组蛋白的修饰中，研究最多的是乙酰化。

2.1 组蛋白乙酰化与肺癌

组蛋白乙酰化是1个可逆的过程。组蛋白乙酰基转移酶将乙酰基部分转移到组蛋白氨基末端上的赖氨酸残基ε一氨基基团，组蛋白乙酰化可导致氨基上的正电荷被消除，减少组蛋白与DNA之间的亲和力，染色质结构松散，RNA聚合酶和转录因子更易接近DNA启动子区域，导致基因转录。因此，组蛋白乙酰基转移酶是转录活化因子。组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)移去乙酰基团，恢复组蛋白的正电性，带正电荷的赖氨酸残基与DNA之间的相互作用可限制核小体在DNA上的移动，使启动子不易接近转录调控原件，抑制转录。甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)与HDAC可能存在同一复合体中，MeCP2通过与HDAC相互作用的抑制转录结构域结合甲基化的DNA和募集Sin3抑制转录。OSADA［24］研究发现HDAC基因的低表达和肺癌有关，原因可能与HDAC抑制肺癌进展中的关键基因有关。

2.2 组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂与肺癌的治疗

根据化学结构和抑制的机制，可分为短链脂肪酸类、环氧化物、环肽、苯酰胺类、异羟肟酸类和其他的混合物［25］，包括曲古抑素A、SAHA、Depsipeptide、丙戊酸，以及一些新的HDAC抑制剂如KD5170、R306465，被用于肺癌细胞株和移植模型的研究。它们的作用机制仍然未能明确，可能通过多种途径起作用，诱导肺癌细胞的凋亡［26，27］。HDAC抑制剂对正常细胞具有低毒性，因而成为1种新的抗肿瘤药，应用前景广泛。

3 联合检测

在肺癌中基因的异常甲基化可能发生在肺癌早期，这为肺癌的早期诊断提供了可能，提示表观遗传改变也可以作为肺癌进展及预后的指标。尽管有些抑癌基因在NSCLC中的甲基化发生的频率偏低，但是对这些基因的联合检测可以极大地提高肿瘤的阳性检出率。在NSCLC的诊断中，利用对一些已经报道的抑癌基因甲基化进行联合检测，可以使肿瘤阳性检出率达到80%以上［28，29］。因此，对多个基因进行联合检测具有更好的临床应用前景。

综上所述，对于肺癌表观遗传学机制的探讨，甲基化研究仍将是主流，而对于组蛋白修饰的研究更是不可忽视。探讨表观遗传学和传统遗传学的关系更是1个热点。采用近年来新建立的DNA甲基化检测、核酸定量分析和基因芯片技术，对大量的基因进行DNA甲基化检测或对这些基因的mRNA表达水平进行分析检测，可能是NSCLC乃至所有肿瘤分子诊断的发展方向。DNA异常甲基化不仅可以在原发性肺癌的肿瘤组织、癌前病变组织中检测到，而且可以在长期吸烟者的血、痰、支气管表皮脱落细胞及支气管刷标本中检测到。因此，构建“甲基化基因谱”可鉴别肺癌发生高危人群。由于基因的异常甲基化不仅是肺癌发生的早期事件，还可通过5－氮杂胞苷，HDAC抑制剂等药物将其逆转，使去表达的基因重新表达。因此，更深入的了解基因发生异常甲基化的机制，不但有助于肺癌的早期诊断，而且有可能为肺癌的防治提供1条新的思路。

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