免疫细胞化学染色和RT-PCR技术在胸腹腔积液检测中的应用

张丽芳 黄海建 陈建伟 王旭洲 宋屿娜 李华良

我们利用胸、腹腔积液制作成细胞块，并进行免疫细胞化学染色和实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)检测，效果良好，介绍如下。

1 资料和方法

1.1 病例来源

收集2010年～2011年在南京军区福州总医院临床送检的胸、腹腔积液细胞学肿瘤阳性病例11例，其中肺腺癌7例，肺大细胞癌1例，卵巢癌3例。所有病例均制作细胞块，行HE、免疫化学 CEA、Vimentin、TTF-1、CK5/6、Ki-67、CKH、CKL、Calretinin、CD56、Syn、CgA染色，8例肺癌病例行RT-PCR检测。

1.2 试剂与仪器

EGFR外显子19和21试剂盒购于北京金菩嘉公司，采用Taqman探针技术检测EGFR基因外显子19 de1-E746-A750、del-L747-P753insS突变，以及外显子21 L858R、L861Q的突变;石蜡标本组织DNA提取试剂盒DEXPAT、Taq酶购于宝生物大连公司;RT-PCR仪为美国 ABI7500，基因扩增 PCR仪为美国ABI9700;所有引物均由北京赛百盛公司提供。

1.3 细胞块制作方法

将临床送检的胸、腹腔积液标本在室温下静置10～20 min，用离心试管取容器底层标本10～20 ml，2 000 r/min离心8～10 min，弃上清保留沉淀物［1］。在试管内加入浓度为40 g/l的中性甲醛(10%中性福尔马林)5～10 ml，与沉淀物混匀，室温固定处理1 h，离心后弃上清，加入中性甲醛5～10 ml，混匀补充固定1 h后离心，弃上清，用滤纸包好沉淀物。若胸、腹腔积液中沉淀物少时，可再加入75%乙醇5～10 ml静置30 min，使沉淀物凝固硬化，便于多收获细胞和取材打包。经常规脱水和石蜡包埋，作4 μm厚切片，每个病例连续切片3张，分别行HE、免疫组化染色及PCR检测。

1.4 免疫细胞化学染色方法

①石蜡切片4 μm，贴附在预先涂有0.01%多聚赖氨酸的玻片上，60～62℃烤片3 h;② 二甲苯脱蜡5 min×3次，100%、95%、80%和60%酒精各5 min，自来水流洗5 min;③0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中高压修复1～2 min，冷却至室温，水洗2 min，PBS(pH7.4)洗2 min×3次;④ 切片入3%H2O2水溶液10 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS洗2 min×3次;⑤ 滴加工作浓度的第一抗体于37℃湿盒内孵育1～2 h，PBS洗2 min×3次;⑥ 滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温孵育20 min，PBS洗2 min×3次;⑦滴加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温孵育30 min，PBS洗2 min×3次;⑧ AEC或DAB显色，水洗2 min;⑨苏木精复染1～2 min，中性树胶封片。所用一抗及二抗 EliVisionTM plus试剂盒等均购自福建迈新公司。

1.5 RT-PCR 检测

石蜡组织DNA提取采用TakaRa DEXPAT试剂盒。将3～5片10 μm厚的石蜡切片放于Eppendorf管中，加入DNA提取液10滴，充分混匀，100℃加热10 min，13 000 r/mim 离心10 min，吸取其上清直接用于RT-PCR反应。DNA经紫外分光光度计定量，0.8%琼脂糖电泳判定其质量。肺癌患者组织中EGFR 19、21外显子RT-PCR检测操作方法严格按照操作说明书进行。

2 结果

2.1 HE 染色

肺腺癌的染色片中:肿瘤细胞排列呈腺样、花环样结构，细胞中等大小，胞质淡染，可见胞质内分泌物，细胞异型性明显，核分裂像不易见。肺大细胞癌的染色片中:肿瘤细胞呈巢状分布，细胞体积大，胞质丰富略嗜伊红，可见胞质内分泌物，部分可见1个核仁，细胞异型性明显。卵巢腺癌的染色片中:肿瘤细胞排列呈腺样、乳头状及巢状等结构，细胞中等大小，胞质嗜碱，可见胞质内分泌物，细胞异型性明显。

2.2 免疫细胞化学染色及RT-PCR检测

7例肺腺癌病例，肿瘤细胞均呈CEA、TTF-1、CKL强阳性表达，Ki-67增殖指数30% ～50%之间，免疫细胞化学染色阴性抗体有 CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA。肺大细胞癌肿瘤细胞呈 CEA、CKL强阳性表达，CKH、CD56、Syn、CgA灶性阳性，Ki-67增殖指数50%，免疫细胞化学染色阴性抗体有CK5/6、Vimentin、Calretinin。3例卵巢腺癌的染色片中:肿瘤细胞呈CKL、CEA强阳性表达，Ki-67增殖指数45%，免疫细胞化学染色阴性抗体有 TTF-1、CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA(表 1)。

2.3 RT-PCR 结果

11例胸、腹腔积液细胞块的EGFR的RT-PCR检测显示，第2例细胞块标本检出EGFR基因外显子19 delE746-A750位点发生突变，其余病例均阴性。

表1 11例胸腹腔积液细胞块免疫细胞化学染色及RT-PCR检测结果

3 讨论

临床送检的胸腹腔积液中，部分为肿瘤性胸腹腔积液，若充分利用并将其制作细胞块进行石蜡切片，行HE染色、免疫组化和基因检测等则可取得理想效果，为诊断和治疗提供依据［2］。但肿瘤性胸腹腔积液中因含有大量红细胞及多种蛋白质，在制作细胞块过程中，40 g/l中性甲醛能及时固定有核细胞，所以收获肿瘤细胞更多;同时经甲醛溶液多次洗涤可去除其中的红细胞和内源性蛋白质，防止免疫细胞化学非特异性染色。

细胞块石蜡包埋HE染色切片中，细胞呈单层平铺状排列，结构清晰易于辨认;其次背景清晰，有诊断价值的信息更多，另外细胞块能连续切片，用于免疫细胞化学和基因突变检测;蜡块可存档，有利于回顾性研究。

免疫细胞化学技术是在细胞学的基础之上进行的，具有以下优点:细胞块石蜡包埋切片能最大限度暴露和修复细胞内抗原，有利于抗原抗体结合，增加免疫细胞化学染色的敏感性;有诊断价值的细胞集中，行免疫细胞化学时可节约试剂量;组织块可连续切片做多项染色，进行诊断或研究;细胞着色充分均匀，防止假阳性结果。

RT-PCR检测可以定性和定量。利用RT-PCR检测非小细胞肺癌患者的EGFR基因突变情况，可指导临床靶向治疗［3］。RT-PCR具有以下优点:RT-PCR技术可以实现标准化操作，支持靶向治疗;特异性好，准确性高，灵敏度高;操作简单、安全、自动化程度高和防污染。

［1］中华医学会编著.临床技术操作规范(病理学分册)〔M〕.第1版.北京:人民军医出版社，2004:42.

［2］尹艳华，李玉红，张 杰.胸腔积液细胞学及免疫细胞化学在鉴别肺转移性腺癌和问皮细胞中的临床价值分析〔J〕.现代肿瘤医学，2007，9(15):1253.

［3］李永文，刘红雨，李颖王，等.实时荧光定量PCR和测序法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较〔J〕.中国肺癌杂志，2009，12(12):1255.