壁层上皮细胞的研究

黄 倩 综述 曾彩虹 审校

肾小球包含四种固有细胞:系膜细胞、内皮细胞、足细胞和壁层上皮细胞(parietal epithelial cells，PECs)。在过去的十年里，系膜细胞、内皮细胞及足细胞在基础及临床研究上进展显著。迄今为止，人们发现许多肾小球疾病与特定细胞的损伤有关，如局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变及膜性肾病，均与足细胞损伤相关，血栓性微血管病与肾小球内皮细胞损伤相关，IgA肾病与系膜细胞损伤相关，但对PECs却仍然缺乏了解，目前尚无资料支持某种疾病与PECs原发损伤相关。然而PECs在多种肾小球疾病中表现活跃，在抗肾小球基膜(glomerular basement membrane，GBM)肾炎和寡免疫复合物性肾小球肾炎中均表现出明显的增生反应;塌陷型FSGS也存在PECs的增生。尽管在这些疾病中PECs的反应是继发于其他的损伤(如GBM、内皮细胞及足细胞)，但PECs与其他肾小球固有细胞之间的相互反应复杂而重要，了解它在生理及疾病状态的结构及功能的改变有助我们更好地了解各种肾小球疾病的发生、发展，进一步为治疗探寻可能的靶点。

PECs的形态特征

十九世纪30年代，英国医师鲍曼阐明了入球小动脉构成肾小球毛细血管袢，再汇合成出球小动脉的循环途径，并叙述了有上皮细胞被覆的肾小囊与近曲肾小管的关系，因而肾小囊后被称为鲍曼囊。鲍曼囊为肾小管起始端膨大并凹陷而成的双层球状囊，内层为脏层(即足细胞)，壁层由鲍曼囊基膜(Bowman's basement membrane，BBM)及覆盖其上的PECs构成。PECs呈扁平的多边形，细胞界限清晰，细胞体积较小，高度为0.1～0.3 μm，含核部位则为2.0～3.5 μm;胞质内细胞器稀少，仅含有一些线粒体、囊泡和高尔基体。扫描电镜见其表面中央附有微绒毛及纤毛，每个PECs平均含0～2根纤毛［1］。

尽管PECs体积较小，但相邻细胞在顶部存在结构复杂且精密的紧密连接。PECs的紧密连接包括几种紧密连接蛋白和钙联素。claudins是紧密连接的主要组成，小鼠 PECs表达的 claudins，包括claudin-1，claudin-2 和 claudin-3［2］;另外小鼠、大鼠和人类PECs均表达 ZO-1(Zonula occludens-1)和occludin，这些紧密连接蛋白的表达方式与紧密连接结构相关。PECs至少表达两种钙联素:K-cadherin(Cdh6)和肾脏特异的钙联素(Cdh16)［3］。

PECs在肾小球尿极与近端肾小管上皮细胞连接，在血管极则与肾小球足细胞连接。尽管形态、功能不同，但在肾脏的胚胎发育过程中，PECs与其他肾脏上皮细胞来源于同一细胞谱系，经过后续诱导，分化为不同种类的细胞并表达特殊的蛋白基因，因而可以通过检测细胞中表达的特殊蛋白基因来区分不同的细胞，如足细胞表达Wilm肿瘤抑制蛋白1(WT-1);PECs不表达 WT-1，但表达PAX2。PAX2基因是Paired Box Gene转录因子家族成员之一，所编码的蛋白作为核转录因子及信号分子参与胚胎的发育调控，具有促进细胞增生和分化的功能。成熟的肾脏仅在集合管系统和PECs少量表达PAX2［4］。实验证明PAX2的表达与足细胞的转录因子WT-1存在相互作用，它们可以形成一个复杂的分子复合体，调控彼此的表达。PECs还表达 CD10(亦称CALLA或中性肽链内切酶)，存在于小鼠或大鼠的PECs，在人类PECs中不表达，是小鼠动物实验模型中检测 PECs的标志［3］。

PECs的生理功能

和其他肾小球固有细胞相比，PECs的研究明显滞后，许多功能尚处于探讨阶段。有作者认为PECs的功能如同其他典型的上皮细胞，包括分泌、吸收、保护、跨细胞转运、感知、清除、选择性渗透等，但缺乏证据。目前根据文献报导的PECs功能如下。

收缩功能和机械感知 实验证实PECs具有收缩功能。Webber等［5］将实验组分为三组，分别将组胺、乙酰胆碱和肾上腺素注射入大鼠体内，然后经颈总动脉灌注固定液并分离肾脏、切片，对照组则直接体内灌注固定液，电镜观察到肾上腺素组的大鼠PECs胞膜轻度折叠，而对照组PECs基膜侧胞膜平滑，表明PECs具有收缩功能。有研究认为PECs通过收缩和舒张调节肾小球囊内压，进而调节肾小球滤过。

PECs顶部具有初级纤毛结构［1］。而肾小管上皮细胞中，纤毛主要发挥化学及机械感知作用，研究显示PECs初级纤毛能够感知水流变化，从而促进细胞内钙的增加，影响基因表达［6］。

蛋白吸收 足细胞在肾小球滤过屏障中发挥了重要的作用，其吸收由于GBM损伤而漏出的白蛋白和其他血浆蛋白，最终导致足细胞损伤。同样，有作者认为肾病综合征时PECs也能通过内吞吸收过量漏出的白蛋白，胞质内过量的白蛋白也最终导致PECs损伤［7］。

选择性半渗透及跨细胞转运 1971年，Webber和Blackbourn［8］通过试验证实PECs能够减少通透性。透射电镜显示PECs有着简单而精密的连接，包括桥粒、中间连接和紧密连接，但由于PECs存在细胞间空隙，半渗透40 kD的辣根过氧化物酶半，同时在PECs胞质的吞饮小泡中也可检出辣根过氧化物酶，说明PECs可能具有选择性半渗透屏障及跨细胞转运的功能。

滤过屏障 2001年，Kriz等［9］即提出 PECs和BBM共同构成屏障，引导原尿的正确流向。实验通过丽丝胺绿标记的铁蛋白示踪剂，显示当PECs从BBM上剥离下来，尿液可渗漏至球旁区域，形成新的尿流通道，并与肾小管上皮细胞和肾小管基膜之间的空间相连续。Ohse等［10］则进一步发现即使PECs在受到损伤后未脱落，但其紧密连接蛋白水平降低，也不能避免尿液向外渗漏，其周间质见炎性细胞浸润。实验显示在抗GBM肾炎模型中，PECs仍然表达ZO-1、occludin及claudin 1等紧密连接蛋白，但免疫组化显示其密度明显减低。另外通过体内示踪剂［德克萨斯红标记的葡聚糖(3 kD)和卵白蛋白(40 kD)］观察，示踪剂不仅分散位于足细胞及PECs胞质，还分散于新月体多层PECs之间、PECs及BBM之间以及球旁区间，充分表明PECs及BBM是原尿的最终屏障。尽管Kriz's研究组应用的是原发性FSGS大鼠模型，而Ohse应用的是小鼠抗GBM模型，两者所应用的示踪剂和检测手段也有所不同，但两个研究均说明了PECs担任着滤过屏障的重要功能。

PECs的增生与凋亡

前文已提及PECs与足细胞来源于同一细胞谱系，但与足细胞不同的是，PECs具有潜在的增生能力。Pabst和 Sterzel［11］发现在实验中非糖尿病 SD大鼠每天PECs的循环再生量为1%，等于肾小球内皮细胞及系膜细胞的循环再生量，但未发现足细胞的再生。人类肾脏活组织标本检查结果与此类似。

新月体肾炎与PECs最为相关，增生的PECs和足细胞(占25%)以及炎性细胞构成了新月体的细胞成分。因而，在PECs研究中，最常用的动物模型即Goodpasture综合征模型，包括实验性自身免疫性肾小球肾炎(experimental autoimmune glomerulonephritis，EAG)和肾毒性肾炎(nephrotoxic nephritis，NTN)。EAG是由GBM或Ⅳ型胶原α3链致敏的动物针对自身肾脏发生免疫反应所导致的。NTN通常称为抗GBM肾炎模型，是由给予针对GBM、肾小球或肾脏皮质的兔子或羊来源的异源性抗体所诱发。两种模型均需用大鼠构造模型，其过程相似，但NTN较EAG模型构造时间短一些。

多种生长因子参与新月体肾炎的发生。Kanemoto等［12］在大鼠新月体肾炎模型中发现新月体可表达结缔组织生长因子mRNA(connective tissue growth factor，CTGF)，但没有检测到巨噬细胞的标志，提示PECs合成了CTGF且参与了瘢痕形成。Fujigaki等［13］通过免疫组化染色发现在正常大鼠PECs血小板衍生生长因子B(platelet derived growth factor B，PDGF-B)及受体PDGFR表达量较低;而抗GBM肾炎早期PECs即表达PDGF-B，新月体附近的PECs中PDGFR表达明显增加，提示其在新月体形成中发挥作用。他们同时还观察到疾病早期PECs及新月体可见转化生长因子 β(Thansforming growth factor，TGF-β)受体(TβRI和TβRII)的表达。Kanemoto［14］也在 CTGF 表达阳性的新月体中发现了 TGF-β1及其受体的共存，而TGF-β1是CTGF的有效诱导剂，提示TGF-β可能在新月体形成中发挥了重要作用。

除了新月体肾炎，在其他与新月体肾炎不相关的疾病中也可见到PECs增生。如Oda等［15］经人类肾活检组织检查发现在感染后肾小球肾炎的早期(1～30d)即出现 PECs的增生。Smeets等［16］通过Thy1.1转基因小鼠FSGS模型，发现当足细胞损伤后，增生的细胞表达PECs的特异标志——CD10。Kihara等［17］发现原发性FSGS也存在PECs的增生。试验显示在足细胞脱落后，肾小球毛细血管袢中间区域基膜裸露，周围区域则被新的基膜与上皮细胞所覆盖，这些区域可以检测到桥粒及细胞间连接，提示PECs在足细胞损伤后发挥一定的修复作用。Dijkman［18］发现在人类FSGS中，增生的细胞也表达PECs标志而不是足细胞的标志。

PECs的增生机制尚处于研究中，细胞周期蛋白为我们提供了一些线索。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制物能够负性调节细胞增生。在生理状态PECs中未检测出CDK抑制蛋白P21和P57，但低水平表达P27。与此形成鲜明对比的是，健康足细胞含有大量的CDK抑制蛋白P21和P57。在FSGS实验模型及人类患者中，PECs高表达DNA合成标志Ki-67和cyclin A，同时伴有P27表达水平降低及P21和P57缺失［19］。

PECs增生的另一个重要调节因子是蛋白基因产物 9.5(Protein gene product 9.5，PGP 9.5)［20］。PGP9.5是一种泛素蛋白，未成熟及成熟的PECs及细胞新月体均能够表达［21］。泛素途径能够通过选择性蛋白降解调节细胞稳定性。泛素途径与细胞周期相互作用，通过降解目标蛋白(如CKIp27)，从而导致细胞增生［22］。PECs及新月体中PGP9.5的表达，提示它可能在调节PECs增生中发挥一定作用。

多项研究显示生长因子在调节PECs增生中发挥作用。如前所提及的CTGF在多种PECs增生的动物模型中均出现表达上调［12］。成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1，FGF-1)和 FGF-2表达也同样上调。Ng等［23］发现纤维细胞性新月体中PECs表达 FGF-2 和 TGF-β。Kanemoto等［12］通过体外实验中也证实FGF-2能够刺激PECs增生。

PECs的增生与凋亡之间保持严格的平衡，以维持肾小球结构和功能。新月体形成时常见PECs和(或)浸润细胞的凋亡(程序性细胞死亡)，甚至有研究认为细胞性新月体向纤维性新月体的转变与PECs的凋亡有关，PECs的凋亡导致细胞数目减少，瘢痕组织取代［24］，因而PECs的凋亡可能是新月体形成后恢复肾小球正常细胞数目的机制，如同增生性肾小球肾炎中系膜细胞的改变。但肾小球损伤所导致的PECs数目减少并不仅限于凋亡这一种方式，还包括细胞脱落。Achenbach等［25］在几种表现为蛋白尿的肾脏疾病(FSGS、膜性肾病、膜增生性病变)的患者尿液中均发现PECs。因此，PECs在受到损伤后可通过凋亡或脱落使细胞数减少，但尚不能明确出现这种反应是否正常。

PECs间充质转分化

上皮间充质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)描述了上皮细胞失去其上皮特征且转变为间充质细胞的过程。肾脏EMT在间质纤维化发生与发展过程发挥重要的作用［23］。既往认为肾脏EMT中，间质成纤维细胞的来源除了自身固有成纤维细胞增生外，还来自于肾小管上皮细胞转分化和骨髓基质细胞分化。近期研究证实PECs能够出现EMT。SNAIL是EMT过程中的重要转录因子，Ikenouchi等［26］研究发现传代的 PECs经 TGF-β 作用后出现转录因子 SNAIL的升高，继而下调claudins、occludin等紧密连接蛋白的表达。TGF-β不仅调节细胞生长及分化，也间接介导EMT形成。在肾功能衰竭及抗GBM肾炎中评估TGF-β作用，发现TGF-β信号可以被分泌型TGF-β受体所阻断，减少新月体形成和间质纤维化［27］。

Ng等［23］发现在新月体肾炎实验模型中PECs α-SMA(肌成纤维细胞的特异标志)增加。Shimizu等［27］发现体内、体外试验 PECs EMT与 Integrin连接激酶(ILK)相关，ILK与细胞附着、细胞外基质形成和EMT相关。在大鼠新月体肾炎时细胞性新月体表达ILK，同时表达PECs标志PGP9.5和肌纤维母细胞标志，提示ILK的表达及活性的增加在PECs向EMT的转化和细胞新月体的形成中发挥作用。

PECs替代修复足细胞

多种慢性肾脏疾病存在足细胞损伤，即使在正常生理状态下，尿中也可发现脱落的足细胞。众所周知，足细胞是有丝分裂后期的细胞，不具备有丝分裂、增生的能力，因而，有人猜测在肾脏必然存在其他细胞再生为足细胞，以替代、修复足细胞损伤。但对于这种细胞来源存在争议，既往有文献推断骨髓来源的干细胞通过屏障再生为足细胞，而2009年多篇文献报道了PECs可能具有局部干细胞潜能。

早在1996年，Gibson等［28］发现在人类肾小球血管极部位的足细胞也位于BBM上，并形成足突和裂隙膜。因此，作者将此亚型细胞命名为顶部足细胞(parietal podocyte，pPods)。扫描电镜发现在人类肾脏中63%肾小球含有pPod，且pPod在BBM和GBM之间形成桥接。Bariety等［29］发现 pPod能够表达数种足细胞的特异蛋白，如肾小球上皮细胞蛋白-1，podocalyxin，nephrin，血管上皮生长因子，αactinin和synaptopodin，同时也表达一些PECs的特异蛋白，如PAX2。

2009年，Apple等［30］发现在肾小球血管极足细胞和PECs之间存在一种过渡细胞，同时表达足细胞及PECs表型;除此之外，他们利用一种特殊转基因小鼠，其PECs可表达诱导的β-gal，通过此方法来标记示踪PECs，在小鼠出生后第5天开始用土霉素诱导 PECs表达 β-gal，分别在 7d、12d、21d 及第 6、12周检测标记细胞的分布，令人感兴趣的是，他们在沿肾小球毛细血管袢找到标记的细胞，这些细胞同样也表达nephrin，且细胞数目随着时间逐渐增加。作者推断在肾脏发育过程中，PECs被招募至肾小球毛细血管袢成为足细胞的干细胞。Ronconi等［31］发现在人类肾脏BBM上存在多效干细胞，能够表达造血干细胞表面标志(CD133+、CD24+)。孤立的干细胞在合适的细胞培养环境下能够分化成多种肾小球细胞类型(包括足细胞)。而且实验证明将这些细胞注射入阿霉素诱导的动物肾脏病模型中可减少蛋白尿和肾脏损伤。

尽管目前对于PECs分化为足细胞仍然存在很多疑问，但极大的鼓舞了人们，为足细胞损伤的相关疾病指明了新的治疗方向。

PECs的研究展望

综上所述，PECs并非我们以往所认为的“无活性”，它对于肾小球的变化积极而及时。尽管只有很少疾病直接与PECs相关，但PECs与其他肾小球细胞之间的相互反应复杂而重要，在起源于足细胞、内皮细胞甚至系膜细胞的相关疾病中发挥着巨大而未知的作用。PECs不仅发挥重吸收蛋白、滤过屏障等重要的作用，而且可能具有干细胞潜能，分化为足细胞。但对于PECs增生、凋亡的调节，PECs向足细胞的转化等，仍有太多未知。我们知道除动物研究模型之外，细胞培养常用于体外进一步研究发病机制。PECs的研究滞后，可能与难以获取纯的PECs样本，缺少确切的PECs模型相关。1997年Mundel等［32］利用转基因小鼠在暴露于干扰素和低温后会表达永生性癌基因 tsA58 Tag这种技术，培养出与体内具有相同特征的足细胞。而Ohse等［33］利用这种模式系统培养出永生化小鼠PECs。我们相信随着研究PECs的新的工具的应用，PECs的细胞和分子生物学研究这一领域必将揭开新的一页，为阐明肾小球肾炎时足细胞损伤后的修复并寻找新的治疗方向提供线索。

1 Arakawa M，Tokunaga J.A scanning electron microscope study of the human Bowman's epithelium.Contrib Nephrol，1977，6:73-78.

2 Doné SC，Takemoto M，He L，et al.Nephrin is involved in podocyte maturation but not survival during glomerular development.Kidney Int，2008，73(6):697-704.

3 Igarashi P.Following the expression of a kidney-specific gene from early development to adulthood.Nephron Exp Nephrol，2003，94(1):e1-e6.

4 Dijkman HB，Weening JJ，Smeets B，et al.Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.Kidney Int，2006，70(2):338-344.

5 Webber WA，Wong WT.The function of the basal filaments in the parietal layer of Bowman's capsule.Can J Physiol Pharmacol，1973，51(2):53-60.

6 Yoder BK.Role of primary cilia in the pathogenesis of polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol，2007，18(5):1381-1388.

7 Yoshida S，Nagase M，Shibata S et al.Podocyte injury induced by albumin overload in vivo and in vitro:involvement of TGF-beta and p38 MAPK.Nephron Exp Nephrol，2008，108(3):e57-e68.

8 Webber WA，Blackbourn J.The permeability of the parietal layer of Bowman's capsule.Lab Invest，1971，25(5):367-373.

9 Kriz W，Hartmann I，Hosser H，et al.Tracer studies in the rat demonstrate misdirected filtration and peritubular filtrate spreading in nephrons with segmental glomerulosclerosis.J Am Soc Nephrol，2001，12(3):496-506.

10 Ohse T，Chang AM，Pippin JW，et al.A new function for parietal epithelial cells:a second glomerular barrier.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(6):F1566-1574.

11 Pabst R，Sterzel RB.Cell renewal of glomerular cell types in normal rats.An autoradiographic analysis.Kidney Int，1983，24(5):626-631.

12 Kanemoto K，Usui J，Tomari S，et al.Connective tissue growth factor participates in scar formation of crescentic glomerulonephritis.Lab Invest，2003，83(11)1615-1625.

13 Fujigaki Y，Sun DF，Fujimoto T，et al.Cytokines and cell cycle regulation in the fibrousprogression ofcrescentformation in antiglomerular basement membrane nephritis of WKY rats.Virchows Arch，2001，439(1):35-45.

14 Kanemoto K，Usui J，Nitta K，et al.In situ expression of connective tissue growth factor in human crescentic glomerulonephritis.Virchows Arch，2004，444(3):257-263.

15 Oda T，Yoshizawa N，Takeuchi A，et al.Glomerular proliferating cell kinetics in acute post-streptococcal glomerulonephritis(APSGN).J Pathol，1997，183(3):359-368.

16 Smeets B，Te Loeke NA，Dijkman HB et al.The parietal epithelial cell:a key player in the pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis in Thy-1.1 transgenic mice.J Am Soc Nephrol，2004，15:928-939.

17 Kihara I，Tsuchida S，Yaoita E，et al.Podocyte detachment and epithelial cell reaction in focal segmental glomerulosclerosis with cellular variants.Kidney Int，1997(Suppl)，63:S171-S176.

18 Dijkman H，Smeets B，van der Laak J，et al.The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.Kidney Int，2005，68(4):1562-1572.

19 Nagata M，Horita S，Shu Y，et al.Phenotypic characteristics and cyclin-dependent kinase inhibitors repression in hyperplastic epithelial pathology in idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.Lab Invest，2000，80(6):869-880.

20 Fujigaki Y，Sun DF，Fujimoto T，et al.Cytokines and cell cycle regulation in the fibrousprogression ofcrescentformation in antiglomerular basement membrane nephritis of WKY rats.Virchows Arch，2001，439(1):35-45.

21 Diomedi-Camassei F，Ravà L，Lerut E，et al.Protein gene product 9.5 and ubiquitin are expressed in metabolically active epithelial cells of normal and pathologic human kidney.Nephrol Dial Transplant，2005，20(12):2714-2719.

22 Lloyd RV，Erickson LA，Jin L et al.p27kip1:a multifunctional cyclindependent kinase inhibitor with prognostic significance in human cancers.Am J Pathol，1999，154:313-323.

23 Ng YY，Fan JM，Mu W，et al.Glomerular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in the evolution of glomerular crescent formation.Nephrol Dial Transplant，1999，14(12):2860-2872.

24 Shimizu A，Masuda Y，Kitamura H，et al.Apoptosis in progressive crescentic glomerulonephritis.Lab Invest，1996，74(5):941-951.

25 Achenbach J，Mengel M，Tossidou I，et al.Parietal epithelia cells in the urine as a marker of disease activity in glomerular diseases.Nephrol Dial Transplant，2008，23(10):3138-3145.

26 Ikenouchi J，Matsuda M，Furuse M，et al.Regulation of tight junctions during the epithelium-mesenchyme transition:direct repression of the gene expression of laudins/occludin by Snail.J Cell Sci，2003，116(Pt 10):1959-1967.

27 Shimizu M，Kondo S，Urushihara M，et al.Role of integrin-linked kinase in epithelial-mesenchymal transition in crescent formation of experimental glomerulonephritis.Nephrol Dial Transplant，2006，21(9):2380-2390.

28 Gibson IW，Downie TT，More IA，et al.Atubular glomeruli and glomerular cysts:A possible pathway for nephron loss in the human kidney?J Pathol，1996，179(4):421-426.

29 Bariety J，Mandet C，Hill GS，et al.Parietal podocytes in normal human glomeruli.J Am Soc Nephrol，2006，17(10):2770-2780.

30 Appel D，Kershaw DB，Smeets B，et al.Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.J Am Soc Nephro，l 2009，20(2):333-343.

31 Ronconi E，SagrinatiC，AngelottiML，etal.Regeneration of glomerular podocytes by human renal progenitors.J Am Soc Nephrol，2009，20(2):322-332.

32 Mundel P，Reiser J，Zúñiga Mejía Borja A，et al.Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.Exp Cell Res，1997，236(1):248-258.

33 Ohse T，Pippin JW，Vaughan MR et al.Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.J Am Soc Nephrol，2008，19(10):1879-1890.