分子标记技术在黄瓜育种中的应用

张 佩 芝

(黑龙江省农业科学院 园艺分院，哈尔滨 150069)

分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶。狭义的分子标记指的就是DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。在国家“863计划”的支持下，我国科研人员利用分子标记技术掌握了一批大农作物重要经济性状的改良方法，并应用于遗传育种实践中，同时建立了分子标记辅助育种与常规育种相结合的技术体系，提高了定向育种的效率和水平。

在重要的园艺作物黄瓜上，则开展了黄瓜抗病性(霜霉病、炭疽病、白粉病、枯萎病、细菌性角斑病)、黄瓜全雌性、黄瓜性别分化等重要性状的分子标记技术研究，构建了一批有应用价值的分离群体，获得了一批重要性状的分子标记或QTL；在国际上首次对黄瓜性别决定基因进行定位，构建了黄瓜欧亚生态型间的饱和永久分子图谱。利用黄瓜白粉病分子标记技术对育种材料进行抗性鉴定和筛选，选出抗白粉病单株40余个。由于分子标记技术在黄瓜育种中的重要地位，本文综述了分子标记技术在黄瓜育种中的应用现状，以期为今后黄瓜育种提供理论指导。

1 分子标记遗传图谱的建立

分子标记遗传图谱是指以遗传标记间重组频率为基础的染色体或基因内位点的相对位置的线性排列图。它可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究提供理论依据和基础。但由于黄瓜的遗传基础狭窄，其遗传图谱相对大田作物如水稻、小麦等较为落后，经典的遗传图谱仅由一百多个颜色、形态和抗病性等基因组成6个连锁群[1]。

人们通过对黄瓜的栽培种的杂交与研究，深入地探索黄瓜的遗传规律得到丰硕成果：Kennard等[2]利用RFLP、RAPD、同工酶、形态和抗病性所产生的标记，进行了黄瓜遗传图谱的构建，得到58个位点的遗传图谱，分属10个连锁群，该图谱覆盖的基因组总长度约为766cm，标记间平均距离约为21cm[3]；Danin-Poleg等[4]以GY14×PI183967为材料，用SSR标记技术构建了黄瓜的遗传图谱，将14个SSR标记定位到8个连锁组群中，整合图谱总长为783.2cm，并发现其中有9个标记与甜瓜相同；张海英等[5]利用黄瓜欧洲温室生态型栽培种高代自交系“欧洲八号”和华北露地生态型品种“秋棚”杂交获得的140份重组自交系，构建了包含有141个AFLP标记、89个RAPD标记、4个SSR标记等234个标记的连锁图谱，由9个连锁组群组成，覆盖整个基因组727.5cm，平均图距3.1cm。整合工作的进行，使黄瓜遗传图谱的密度和覆盖基因组的长度显著增加，为基因定位和分子标记辅助育种提供了理论依据[6]。

2 相关基因的定位

生物的性状是由基因控制的，想获得优良的经济性状就要寻找与质量性状基因紧密连锁的DNA分子标记。目前，随着新的分子标记技术不断成熟、黄瓜遗传图谱的日趋完善，与黄瓜重要经济性状相关基因的定位也取得了很大进展。发表的黄瓜各类形态学基因已达到132个。顾兴芳等[7]运用AFLP技术，采用集群分析法(BSA)进行与黄瓜果实苦味基因连锁的分子标记的研究，找到了与苦味基因连锁的两个显性AFLP标记；陈学好等[8]用65条ISSR引物进行PCR扩增筛选，其中引物N92在亲本和DNA池之间扩增出一条大小为850bp多态性片段，经F2代群体135个单株验证，该片段稳定出现，在单性结实植株中表现为无带，在非单性结实植株中表现为有带，可以作为鉴别单性结实与非单性结实的标记引物。

3 亲缘关系的分析与种质资源多样性的检测

分子标记能够有效地进行种质亲缘关系分析和遗传多样性的研究。该技术在黄瓜上也有这深入的研究和报道：Dijkhuizen等[9]利用RFLP标记评价两组黄瓜种质的遗传多样性。在第一组16个品系中，RFLP标记反映了与同工酶分析一致的品种间的亲缘关系；第二组35个栽培品种中，RFLP分析揭示了与形态及实际系谱关系相一致的品种间的亲缘关系，认为RFLP可用于黄瓜分类鉴定和品种保护；Staub等[10]用同工酶和RAPD标记评价了38个黄瓜品系的多态性。顾兴芳等使用AFLP技术对国内外多个生态型的15份黄瓜品种进行了遗传亲缘关系分析，所用14个引物组合有9个组合得到的谱带清晰、齐全。陈劲枫等采用SSR和RAPD两种分子标记对黄瓜属22份不同类型材料的亲缘关系进行了研究，结果表明，野黄瓜与黄瓜间的遗传距离小于其与甜瓜间的距离[11]。

黄瓜的品种分类方法较多，包括地理分布和形态等不同变种或类型的界定方式。我国的黄瓜育种研究存在育种材料亲缘过分单一的问题，育种工作进展艰难。因此对黄瓜各种生态类型之间的亲缘关系的研究，有助于合理引进国外种质资源和充分利用野生种质资源，有效地进行亲本选择选配，提高育种效率。

4 分子标记在黄瓜育种中的辅助选择作用

植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在。对目标性状进行正确选择和有效分离是植物育种的中心环节。分子标记辅助育种是现代分子生物学与传统遗传育种的结合，借助分子标记对育种材料从DNA分子水平上进行选择，可以对与目标性状连锁的单个或多个基因进行检测、定位和跟踪，并可以检测是否有不良性状基因的连锁，减少了育种选择的盲目性，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良，提高育种效率[3]。

Witkowicz等[12]利用NILs结合BSA法，找到了与黄瓜性别表现相关的AFLP标记。黄瓜性别分化由3个主要基因控制：F、M和G，通过基因互作共同决定黄瓜性别；陈劲枫等[13]也利用RAPD结合BSA法对黄瓜性别特异基因进行了分子标记筛选，发现全雌性单株都含有特异片段B11-1000，并以ACC合酶基因的特异引物检测分离群体单株，发现该酶基因不具有性别特异性，这与前人研究结果不同。黄瓜全雌性基因紧密连锁的分子标记的获得，为早期进行性别鉴定提供了理论指导。利用分子标记的方法在黄瓜育种中起到了巨大的作用，即让所得品种更快捷地达到育种目标，又准确地使基因更好的表达，为育种工作更好更快地完成提供了理论基础。

5 品种纯度鉴定

在植株育种中最大的困难之一就是品种纯度的鉴定，常规的鉴定方法是根据田间表型性状进行鉴定，后来发展为利用同工酶的方法，但是两种方法均存在着不同程度的缺陷。现在的分子标记育种弥补了以上两种方法的缺点，该方法快速(数小时或数天)、准确、简便、成本也不太高，在幼苗或种子阶段就可鉴定出品种的纯度。

Matsuura等[14]发现利用RFLP分析可快速检测黄瓜杂交一代F1品种的纯度。孙敏等从102个RAPD引物中筛选出应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物32条，并建立了应用于鉴定亲本和杂交种子的RAPD指纹图谱。Truksa等利用3个黄瓜亲本材料，分析了其RAPD多态性，发现多态性程度较差，认为RAPD分析不适于验证黄瓜杂交种纯度。

在黄瓜育种上，常规方法乃至部分改良方法中均不同程度地存在一些缺点，而新兴的技术——分子标记育种能够在某种程度上弥补常规方法的不足。分子标记育种的知识体系庞大而系统，它是具有特异性和针对性的，通过今后更加系统深入的研究，该技术有着广阔的前景，对以后的黄瓜种质资源创建、管理以及利用必将发挥更加巨大的作用。

[1]Pierce LK，et al.黄瓜的基因和连锁群[J].中国蔬菜，1993，(4):54～57.

[2]KENNARD W K，POETTER.K，DIJKHUIZEN A，et al Linkages.amongRFLP，RAPD isozyme disease-resistance and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber[J].Theor.Appl.Genet.，1994，(89):42～48.

[3]孙振久，王亚娟，张显.黄瓜分子标记辅助育种研究进展[J].西北植物学报，2006，26(6):1290～1294.

[4]DANIN-POLEG Y，REIS N，BAUDRACCO-ARNAS S.Simple sequece repeats inCucumis mapping and map merging[J].Genome，2000，(43):963～974.

[5]ZHANG H Y，GE F W，WANG Y J，XU Y，CHEN Q J.Construction of a renference linkage map for cucumber[J].Acta Horticultural Sinica，2004，31(5)：617～622.

[6]魏惠军，杜胜利，马德华.分子标记在黄瓜遗传育种研究中的应用[J].生物技术通报，1999，(2)：28～29.

[7]顾兴芳，张素勤，张圣平.黄瓜果实苦味Bt基因的AFLP分子标记[J].园艺学报，2006，33(1):140～142.

[8]陈学好，王佳，徐强，嵇怡，梁国华.一个与黄瓜单性结实基因连锁ISSR标记[J].分子植物育种，2008，3(1)：85～88.

[9]Dijkhuizen A， et al. RFLP variation and genetic relationships in cultivated cucumber Euphytica，1996，90(1):87～97.

[10]Staub JE.Comparation of isozyme and random amplified polymorphic DNA data for determining intraspecific variation in cucumis.Genetic Resources and Crop Enalrtion，1997，44(3):257～269.

[11]王桂玲，秦智伟.分子标记技术在黄瓜育种中的应用[J].世界农业，2005，(1)：46～47.

[12]WITKOWICZ J，URBANCZYK-WOCHNIAK E，PRZYBECKI Z.AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativusL.) nearisogenic lines differing in sex expression[J].Cell.Mol.Biol.Lett.，2003，8(2):375～381.

[13]陈劲枫，娄群峰，余纪柱，庄飞云.黄瓜RAPD基因的分子标记[J].上海农业学报，2003，19(4):11～14.

[14]Matsuura S， et al. An approach for rapid checking of seed purity by RFLP Analysis of nuclear DNA in F1 hybrid of cucumber L. Joural of the Japanese Society for Horticultural Science，1994，63(2):379～383.