消化道恶性肿瘤化疗药物相关基因检测临床应用价值

姚家奎,王晓铃,柏斗胜,孙长江

(扬州大学临床医学院,江苏扬州,225001)

消化道恶性肿瘤是我国肿瘤患者死亡的主要原因之一,严重危害人民健康,其主要治疗手段是外科手术,但大多数患者就诊时已属中晚期,化疗和放疗技术的发展提高了肿瘤外科根治切除术后的疗效,又为不能实施手术切除患者提供了一个新的治疗途径。目前尽管肿瘤化疗取得了一些进展,但由于在不同种族人群中,不同个体间仍有显著的化疗有效率、毒性反应的异质性。据有关统计数据,目前应用的抗肿瘤药物对至少70%的患者疗效有限,20～40%患者甚至有可能接受了错误的药物治疗;据美国癌症协会估计,90%以上的患者死于不同程度的肿瘤细胞耐药性,因此逆转肿瘤细胞的耐药性,提高化疗药物的敏感性对癌症的治疗具有积极意义[1]。随着药物基因组学以及在此基础上发展的蛋白组学、转录组学等高通蛋白和超高通技术的出现,使临床医师和分子生物学家很快就找到了共同的关注点,即从个体基因组中分析和鉴定患者之间存在的疾病相关的个体差异,并利用这些差异来合理地筛选药物指导临床治疗。本文就消化道肿瘤患者化疗药物基因组学基因型进行了分析,以便对选择化疗药物个性化治疗进行指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例选择2007年1月～2010年10月在本院住院就诊患者共35例,其中胃癌15例;肠癌6例;食道癌4例;胰腺癌6例;胆管癌2例;胆囊癌2例。男性19例,女性 16例;最大年龄 70岁,最小年龄45岁,平均59岁。所有手术后标本均经病理学检查确诊。

1.2 试剂与TaqMan等位基因检测及分型方法

所有患者化疗前抽取血液标本2.0 mL注入EDTA抗凝管,充分混匀后待测相关基因型。应用血液基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(Promega,USA)提取基因组DNA,基因分型采用美国应用生物系统公司(ABI)生产的SNP基因分型试剂盒及TaqMan PCR混合试剂盒。PCR反应 体 系 为 25 μ L,包 括:TaqMan UniversaL PCR Master Mix(AppLied Biosystems,Foster City,CA,USA)12.5 μ L,20 ×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μ L,25 μ g/mL 的基因组 DNA 2 μ L,超 纯 水 9.25 μ L。 在ABI7000PCR仪扩增:95℃10 min激活Mix里的金牌DNA扩增酶;继而92℃15 s变性,60℃1 min退火及延伸,共40个循环。ABI3130DNA测序仪分析SNP分型结果。为保证基因分型的准确性,所有检测标本均由另一操作者进行重复实验,结果与第1次完全一致。

2 结 果

基因分型及突变类型35例消化道恶性肿瘤患者检测结果:T/T基因型11例(11/35);G/A基因型5例(5/35);A/A基因型8例(8/35);I/V基因型3例(3/35);V/V基因型4例(4/35);R/R基因型4例(4/35)。

3 讨 论

随着人类基因组计划的完成以及对肿瘤化疗药物应用研究的发展,人们逐渐认识到个体基因的差异,最为常见的差异就是单核苷酸多态性(SNP)。发现一些药物的毒副作用和这些位点紧密相关,其主要机理是若干位点的变化使药物代谢基因的活性下降,有些则直接造成该基因活性的丧失,从而使药物代谢产生障碍引起一系列严重的化疗毒副作用。因此,如果能对这些基因位点进行检测,预测药物是否将对病人产生不良作用,实现化疗药物的针对性、个体化用药,就能从根本上缓解病人痛苦,提高病人在化疗过程中的生存概率。所以,肿瘤治疗的个性化越来越受到医学界的重视,临床开展治疗前基因型筛选更具有重要意义。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的类似物在人体内代谢成5-氟去氧尿嘧啶(F-dump)后,与胸腺嘧啶合成酶(TS)形成稳定化合物,抑制TS功能,由于该酶负责细胞内的去氧单磷酸尿苷(dUMP)转化成去氧单磷酸腺苷(dTMP),一旦它的功能被抑制,将细胞内的唯一dTMP合成途径被截断,导致其含量不足,影响细胞复制DNA的合成,进而将细胞生长抑制在细胞周期中的DNA合成前期(即G1期、S期之间),以达到杀死癌细胞的目标。通过MTHFR(C677T)多态性基因检测,预测5-FU治疗的疗效,T/T等位基因较其他基因型要敏感,疗效好;与肿瘤化疗药物代谢相关的二氢嘧啶脱氢酶(DPD),是另一种主要参与嘧啶分解代谢的酶,DPD是常用化疗药物5-FU以及口服嘧啶类化疗药物的代谢限速酶,其活性在人群中存在个体差异,进入体内的5-FU80%是经由DPD代谢清除,在5-FU分解代谢中起关键作用。该酶失活影响5-FU这种药物的分解代谢,造成治疗过程中有毒药物在体内的积累,引起严重的毒副反应。该基因突变型的癌症患者接受5-氟尿嘧啶治疗即会产生强烈的毒副作用甚至死亡。许多研究表明临床上可以见到DPD酶活性部分或完全缺乏的患者接受5-FU化疗后疗效明显,但出现严重毒副作用,DPD酶活性受DPD酶基因(DPYD)多态性的影响,而基因多态性>90%的表现形式为单核苷酸多态性(SNP)[2]。SaLgueiro等[3]的研究表明,DPYD基因14外显子的突变与相当部分5-FU相关严重毒副反应的发生有关。为提高这类药物的疗效同时预防和减少其毒副反应,更好地实现5-FU及嘧啶类药物的个体化治疗.通过DPD＊2A多态性基因检测,预测对患者毒副作用,G/G型不增加毒副作用,G/A及A/A增加患者发生不良反应的危险性。DPYD的SNP检测具有重要的临床意义。据有关研究报道使用5-FU治疗而发生毒性副作用的肠癌患者中约有17%～57%带有DPD＊2A基因型,可见此SNP影响了DPD活性表现,DPD活性高低直接决定了5-FU进入合成代谢和产生核苷酸类似物的量,药代动力学研究也显示DPD活性缺乏可导致5-FU体内清除受阻,半衰期显著延长,分解减弱而合成增加,细胞毒性也相应增强。因此若能在5-FU治疗前先行检测患者是否带有DPD＊2A,将可以预测5-FU治疗的副作用,若是检测发现患者带有此SNP,则可避免使用5-FU治疗,若无法避免则应于患者接受治疗后密切追踪其治疗反应。作者还通过MTHFR(C677T)多态性基因检测了解MTX(甲氨喋呤)毒副作用,T/T等位基因较其他基因型毒副作用增加。

GSTs(谷胱甘肽转移S酶类)为人体内最重要的Ⅱ相代谢酶,它是一组超基因家族蛋白,现已发现有 4种类 型:α(GSTA)、π(GSTP)、μ(GSTM)、θ(GSTT),其主要分布于消化、呼吸道等处上皮。该酶的作用主要催化还原谷胱甘肽与许多具有遗传毒性的复合物结合,增加水溶性,利于毒物从尿和胆汁排泄,在多数情况下是一种解毒过程;具有间接诱导DNA修复,维持细胞基因组完整性的作用,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。研究发现GSTs过度表达与肿瘤耐药相关,特别是与铂类药物的耐药性关系密切[1]。GSTs基因多态性不仅与肺癌、肠癌等肿瘤遗传易感性有关,其活性变化还与恶性肿瘤对化疗药物的敏感性相关,导致GST活性下降的遗传变异会增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[4-6]。GSTP1是GST家族的主要成员,它在肝脏组织中有较高表达,其基因多态已被证实可导致GSTP1酶活性显著降低;当导入外源性GSTP1基因或在诱导癌细胞耐药过程中细胞表达GSTP1时,细胞内的化疗药物特别是铂类药物的贮留量则明显减少。所以,认为GSTP1可能是抗药性的标志之一,与肿瘤细胞对抗癌药耐受性的获得有关。STOEHLMACHER等[7]研究结果证实,GSTP1 ILe105VaL基因多态性可能与晚期结直肠癌病人对铂类化疗药物疗效相关。通过检测GSTM1多态性,缺失型的较其他基因型要敏感,疗效好;GSTP1(I105V)基因,I/V,V/V等位基因较其他基因型要敏感,疗效好。本实验应用TaqMan-MGB探针等位基因分型技术检测GSTP1基因I105V的多态性,分析消化道恶性肿瘤病人基因多态性与应用铂类为基础的药物化疗后疗效的关系,可用于指导该类药物的个体化使用,提高临床治疗的针对性和可预见性。

XRCC1(X线交错互补修复基因1)是一种与DNA单链损害碱基切除修复直接相关的蛋白质,其至少包括3种常见的遗传多态性,其中Arg399※GLn变异在肠癌中最为常见,其发生与DNA损害标志物水平上升有关。作者通过XRCC1(R399Q)多态性检测到4例R/R等位基因。对于患者化疗药物疗效,R/R等位基因较其他基因型(R/Q、Q/Q)敏感、疗效好。近年来国内相关研究显示,胃癌患者XRCC1多态性与疗效有关[8]。国外研究表明XRCC1基因的多态性可预测铂类化疗药物治疗转移性肠癌疗效,StoehLmacher等[9]研究了61例接受奥沙利铂联合5-FU治疗的转移性肠癌患者XRCC1基因密码子399多态性位点进行基因分型。研究发现了位于10号外显子的R399Q的多态性,在11例有效的病例中,有8例(73%)是RR基因型,3例(27%)是杂合子(RQ);在 10例进展的病例中,3例(30%)是QQ变异基因型而5例(50%)是杂合子;稳定的病例中,15例(38%)是R等位基因的纯合子,23例(58%)是杂合子,2例(4%)是Q等位基因的纯合子。

总之,由于药物在体内敏感性影响因素复杂,目前肿瘤患者化疗药物基因型测定研究的真正目的可能不在于筛选哪些药物在体内应用时更为敏感,而在于筛选体内应用时可能不敏感的药物,以避免盲目化疗可能导致的毒性反应。所以化疗前及化疗过程中动态检测药物敏感性和抗药性,是实现化疗个体化和提高疗效的重要基础,合理选择化疗药物,可有效延长癌症患者生存期和避免患者不必要的身体和经济上的负担。

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