Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表达及其病理特征的相关性研究

刘灿均,蔡圣强,车彦军

(江苏省靖江市人民医院外科,江苏靖江,214500)

胃癌是最常见的癌肿之一,占我国消化道肿瘤的第一位。近年来的研究表明,Wnt-1信号传导途径的不恰当激活参与多种人类肿瘤的发病而蛋白激活酶受体-1(Proteinase-Activated Receptor-1 PAR-1)基因可能是与肿瘤转移相关的基因[1-2]。因此Wnt-1和PAR-1在胃癌中的基因表达以及与胃癌的病理特征3者间是否有相关性,目前国内文献尚无报道。本研究采用免疫组化的方法检测胃癌及正常胃组织中Wnt-1和PAR-1的基因表达,研讨2者在胃癌组织中表达的相关性,以及与胃癌病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2008年1月～2010年12月的胃癌根治术切除病例的、经10%甲醛固定的石蜡包埋的胃癌组织标本78例,其中男51例,女27例;年龄39～83岁,平均58.3岁。所有纳入研究对象的病例均接受胃癌根治术,术前均未行放、化疗和生物免疫治疗。根据入选病例的性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况以及TNM分期等病理特点进行分组,其中年龄分为<60岁组和≥60岁组,按肿瘤大小分为肿瘤直径<5 cm组和肿瘤直径≥5 cm组,淋巴结转移情况按目的蛋白表达阳性与否分为2组,其余病理特征均按等级进行分组。同时对其中50例患者的癌旁正常胃组织作为正常对照。

1.2 试剂

Wnt-1山羊抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司;PAR-1兔抗人多克隆抗体购自英国abcom公司;一抗工作液浓度均为1:100。二抗的山羊SP试剂盒和兔SP试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色

将入选病例的手术标本和正常对照标本经石蜡包埋后,4 μ m后的切片贴于载玻片上,经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水,PBS洗3次,3 min/次;热修复抗原后室温冷却,PBS洗5 min后,在过氧化氢甲醇溶液中浸泡30 min,以抑制内源性过氧化物酶的活性;然后PBS洗3次,3min/次;滴加正常的山羊血清封闭液室温下20 min,甩去多余液体,滴加一抗4℃过夜。37℃下复温45 min,PBS洗3次,3 min/次,加生物素化二抗,室温下30 min;DAB显色,自来水洗涤后核苏木素复染,脱水,透明树胶封片。以PBS替代一抗行阴性对照。阳性片一抗体说明书自带的阳性结果作为参照。

1.4 结果判定

Wnt-1异常表达于细胞质中;PAR-1表达于细胞质和细胞膜上。采用二级计分法来评估免疫组化的染色效果,首先按染色强度评分:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;然后按阳性细胞率评分:细胞内无阳性染色者或阳性细胞率<10%者为0分,阳性细胞率10%～25%者为1分,阳性细胞率25%～50%者为2分,阳性细胞率50%～75%者为3分,阳性细胞率>75%者为4分。将每张片子的的随机的5个视野中2者评分结果相加的平均值得到的即为免疫组化评分。阳性结果判断:≤3分者为阴性(-),>3分者为阳性(+)。

2 结 果

2.1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原发灶和正常为组织的表达

Wnt-1异常表达于细胞质中;PAR-1表达于细胞质和细胞膜上,2者在胃癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织(P<0.05),有显著统计学意义,见表1。

表1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原发灶和正常为组织的表达

2.2 Wnt-1和PAR-1的表达与淋巴结转移的关系

分别将Wnt-1和PAR-1表达阳性与否分为2组:即目的蛋白表达阳性组和目的蛋白表达阴性组,观察每组病例的淋巴结转移情况,淋巴结转移情况分为 N0、N1、N2、N3。采用 Wilcoxon 秩和检验进行统计学处理,结果显示:Wnt-1表达阳性组和Wnt-1蛋白表达阴性组相比较,有显著统计学意义,从数据中可以看出,Wnt-1表达阳性组具有更高的淋巴结转移率;同样的,PAR-1表达阳性组和PAR-1蛋白表达阴性组相比较,PAR-1表达阳性组具有更高的淋巴结转移率(P<0.01),见表2。

表2 Wnt-1和PAR-1的表达与淋巴结转移的关系

2.3 Wnt-1和PAR-1的表达与病理特征的关系

本研究中,将患者分别按性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况以及TNM分期等病理特点进行分组,根据免疫组化染色情况分别进行χ2检验,结果显示:Wnt-1和PAR-1的表达与患者的性别和年龄无关,与肿瘤的大小、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况以及TNM分期密切相关(P<0.05),见表3。从表中数据可以看出,肿瘤越大、肿瘤分化程度越低、浸润深度越深、淋巴结转移率越高以及TNM分期越晚Wnt-1和PAR-1的表达率也越高。

表3 Wnt-1和PAR-1的表达与病理特征的关系

2.4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表达的相关性研究

为了更好地分析Wnt-1和PAR-1二者在胃癌中表达的相关性,本研究经免疫组化染色评分结果分为4个等级,即0～1分、2～3分、4～5分和6～7分,各等级中Wnt-1和PAR-1的表达情况即构成比见表4;各构成比采用Spearman相关分析进行统计学处理,结果显示呈现出正相关关系。

表4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表达的相关性

3 讨 论

Wnt基因于1982年发现,与小鼠乳腺癌,最初被命名为NT-1,后发现与果蝇的无翅基因wingless(wg)高度同源,因此被命名为Wnt基因。Wnt蛋白是一种由Wnt基因编码的分泌糖蛋白,分泌后与细胞表面基质及其特异性受体卷曲蛋白(Fz)相互作用,通过其下游散乱蛋白(DSH)、GSK23β 、β2catenin 、APC 等磷酸化和去磷酸化过程来完成Wnt信号传递,组成Wnt途径。Wnt通路是一种对细胞增殖和分化具有重要调节作用的信号转导系统,是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约的复杂体系。近年来发现很多肿瘤发生与Wnt信号异常相关,在胃癌的发生发展中也不乏Wnt信号通路异常的报道[3]。

本研究发现Wnt-1在胃癌组织中有表达,在正常胃黏膜组织中无表达,与正常组织相比,差异具有统计学意义。这本实验研究发现,Wnt-1与癌组织的分化高低有关,高分化组织中表达低于低分化组织,与Jnsson等[4]在乳腺癌组织中研究的结果高分化者表达高,低分化者表达较少相反。Jnsson等对乳腺癌进行的相关研究表明,Wnt表达丢失可能是一个独立于淋巴结状态和肿瘤大小的,有用的预测复发的标志物,Wnt的丢失增加乳腺浸润性导管癌的早期复发和死亡的风险,他们提出,Wnt蛋白在乳腺发挥肿瘤抑制作用。目前认为不同肿瘤中Wnt的作用机制可能存在差异[5]。本实验研究还发现Wnt-1在胃癌组织中表达水平与肿瘤大小、侵入深度、淋巴结转移、TNM 分期有关。这与Khor等[3]结直肠癌的研究相似。这也与国外学者Katoh[6]检测结果基本一致,Katoh在对人类癌细胞中Wnt-1的表达研究中发现:在GCOKAJIMA细胞系和胰腺癌BxPC-3细胞系中Wnt-1 mRNA的表达量明显升高,在原发型胃癌患者中Wnt-1mRNA的阳性表达率占50%。因此认为Wnt-1可以作为评价胃癌生物学行为较好的指标,同时也为抗癌药物的研究提供了新靶点。

蛋白酶激活受体(PAR)又称凝血酶受体,PAR-1是PARs家族的主要成员,是最早发现的PARs分子,人PAR-1基因定位于染色体5q13,含有 2个外显子,由425个氨基酸组成,蛋白核心分子量为47 000,具有典型的G蛋白耦联膜受体结构特征,它介导凝血酶的细胞生物学效应[7]。研究表明,PAR-1参与多种恶性肿瘤侵袭转移等复杂生物学行为,PAR-1表达水平可能与乳腺癌骨转移特性相关[2],与前列腺癌转移相关,在黑色素瘤也是随恶性度增加而阳性表达提高,最近研究显示,PAR-1表达水平也与胃癌的侵袭转移等生物学特性密切相关[8]。目前国内有关PAR-1在肿瘤中表达的研究报道还见于肺癌、宫颈癌、鼻咽癌,可见PAR-1与恶性上皮性肿瘤的恶性侵袭和淋巴结转移等生物学行为密切相关。

本研究结果示PAR-1的表达在胃癌组织中高于癌旁胃组织,有明显的统计学意义;并且PAR-1的表达水平与肿瘤大小、侵入深度、淋巴结转移、TNM分期有关。由此可见,PAR-1在恶性肿瘤的侵袭转移等生物学行为中起着重要作用,其详细作用机制远未被阐明,需要进行大量的实验室研究。本研究结果表明,Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表达成正相关,但具体的作用机制尚不清楚,我们推测,PAR-1在胃癌中的表达是否与通过激活Wnt信号途径而发挥作用有关尚待进一步研究探索。就本研究的临床资料和病理学检测结果可明确,PAR-1与胃癌侵袭和转移有关,可以作为判断胃癌患者预后的一个生物学指标。

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[2]Beaulieu L M,Church F C.Activated protein C promotes breast cancer cell migration through interactions with EPCR and PAR1[J].Exp Cell Res,2007,313(4):677.

[3]Khor T O,Gul Y A,Ithnin H,et al.A comparative study of the expression of Wnt-1,WISP-1 survivin and cyclin-D1 in colorectal carcinomas[J].Int J Colorectal Dis,2006,21(4):291.

[4]J nsson M,Dejmek J,Bendahl P O,et al.Loss of Wnt-5a protein is associated with early relapse in invasive ductal breast carcinomas[J].Cancer Res,2002,62:409.

[5]O′Connell M P,Weeraratna A T.Hear the Wnt Ror:how melanoma cells adjust to changes in Wnt[J].Pigment Cell Melanoma Res,2009,22:724.

[6]Katoh M.Expression and regulation of WNT-1 in human cancer:up-regulation of WNT-1 by beta-estradiol in MCF-7 cells[J].Int J Oncol,2003,22(1):209.

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