冬凌草甲素对微卫星不稳定结直肠癌的作用在体研究

戴功建,金黑鹰

(南京中医药大学第三附属医院全国肛肠医疗中心,江苏南京,210001)

结直肠癌是消化系统最常见的肿瘤,化疗是其主要治疗手段之一,新型抗肿瘤药物的开发利用是目前研究的主要课题。冬凌草甲素是一种从唇形香茶菜属植物中提取的一种贝壳杉烯二萜类天然有机化合物,近年来的研究表明冬凌草甲素对体内的各种肿瘤都有一定的抑制作用,临床上报导对食管癌、胃癌的应用取得了一定的疗效[1-2],但在结直肠癌的研究鲜有报导。从分子生物学上,结直肠癌可以分为微卫星不稳定性(MSI)和微卫星稳定性2种,MSI结直肠癌占结直肠癌的20%～30%,是由于错配修复基因表达缺失,DNA复制错误增加,微卫星不稳定,导致结直肠癌发生[3]。许多研究认为冬凌草甲素明显激活了细胞增殖、细胞周期的各个阶段和抗凋亡作用[4-5]。本研究继续探索冬凌草甲素对错配修复基因表达缺失的结直肠癌的作用,旨在为其抗肿瘤作用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验材料

细胞株:Lovo细胞(hMSH2缺失结肠癌细胞株)购自中国科学院上海细胞生物研究所。

冬凌草甲素制备:冬凌草甲素购自中国药品生物制品鉴定所标准品,以蒸馏水配置成50 mg/mL的溶液,灭菌后备用。

实验动物:BALB/C nu/nu裸鼠,SPF级,购自北京科丽华实验动物中心,体重24～28 g,分笼饲养于独立送风笼具,室温控制在24℃～25℃,相对湿度50%～60%。

1.2 实验方法

细胞株及细胞培养:人结肠腺癌细胞株(Lovo、SW480)购自中国科学院上海细胞生物研究所。Lovo、SW480细胞以 RPMI-1640培养基,10%小牛血清,在37℃,5%CO2培养,0.25%胰酶-EDTA消化,PBS洗2次,调整细胞浓度制成1×106的细胞悬液。

裸鼠皮下接种模型的建立:裸鼠颈部右侧皮肤消毒,用一次性1 mL注射器将Lovo细胞悬液注入皮下0.2 mL/只。注射完毕后,对注射部位进行观察,约4周成瘤,对成瘤小鼠进行观察,待其自然死亡后解剖观察肿瘤特点,肿瘤在肺、肝、肠系膜处转移情况。

结肠造口结肠癌原位移植模型的建立 氯胺酮(0.17 mg/mL)裸鼠腹腔注射麻醉,左腹部碘酊消毒,将皮肤及腹膜剪一小口,将裸鼠盲肠提出腹壁约0.5 cm,以5-0缝线将盲肠与周围皮肤缝合固定,术后注意补充葡萄糖生理盐水,加强营养,术后2～3 d造口部位会结痂,约1周结痂脱落,露出肠道。术后4周取裸鼠皮下接种肿瘤,切取1 mm3的肿块2块,种植于造口处盲肠,待肿瘤生长至5 mm时开始进行冬凌草甲素处理。

分组及用药:选取已结肠造口结肠癌原位移植模型40只,设空白对照组10只、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和10 mg/kg冬凌草甲素处理组各10只。冬凌草甲素组予以相应剂量冬凌草甲素腹腔注射,1次/d,对照组予以等体积生理盐水腹腔注射,连续5 d,观察肿瘤增长情况。

肿瘤体积和抑制率计算:分别于用药前、用药后 1、2、3、4和 5周末测量在体肿瘤大小,计算肿瘤体积和肿瘤抑制率。Genescan方法检测微卫星不稳定情况和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段的大小变化。肿瘤体积估计公式为:(肿瘤长轴×肿瘤短轴2)/2;肿瘤抑制率估算公式:(用药后肿瘤体积-用药开始肿瘤体积)/用药开始肿瘤体积。

肿瘤组织中MSI以及转化生长因子β1、转化生长因子β2和胰岛素样生长因子片段的大小变化检测:分别于用药前和用药后 3、7、14、21、28d于肿瘤处取材,采用Genescan法检测微卫星不稳定情况,并检测转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β2和胰岛素生长因子(IGF)片段的大小变化,方法、使用试剂及引物序列参考文献[6-7]。抽取基因组DNA,以聚合酶链反应(PCR)方法扩增上述片段,反应体系20 μ L,反应条件为:95℃预变性15 min,94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,72℃充分延伸25 min。共30个循环 。取 1 μ L PCR 反应产物与 0.4 μ L LIZ(内标)和9 μ L甲酰胺混合,然后在ABI3100-Avant测序仪上毛细管电泳法电泳 45 min。DatacoLLection软件自动进行数据收集和处理,并生成原始的样品数据文件。

2 结 果

2.1 使用冬凌草甲素处理结肠造口的结肠癌原位移植模型的结果

5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和 10 mg/kg 3个治疗组在注射冬凌草甲素后,1周开始出现肿瘤的缩小,2～3周肿瘤缩小最多,在3周以后肿瘤开始增长;而对照组肿瘤一直处理增长状况。在2、3、4、5周,治疗组和对照组肿瘤抑制率比较差异有统计学意义(P<0.01);方差分析进行3个治疗组之间的肿瘤抑制率的比较,差异无统计学意义。

2.2 结肠造口的结肠癌原位移植模型的肿瘤微卫星不稳定和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段大小变化

在空白对照组,能扩增到的4个微卫星标志和TGFβ1、TGFβ2和 IGF 均出现延长和缩短。在空白对照中,出现了MSI和一些简单重复序列的延长和缩短,提示Lovo在增殖过程表现出明显的含简单重复序列基因的突变,符合Lovo细胞的增殖特点,在使用冬凌草甲素治疗后,微卫星标志和携带简单重复序列的基因的变异仍呈现不稳定趋势,较治疗前无明显变化。

3 讨 论

冬凌草甲素具有抗肿瘤、抗突变的重要作用[8-9],目前研究认为其抗肿瘤的作用主要是通过诱导细胞凋亡而发挥作用[10-11],在前期的研究中,发现冬凌草甲素对微卫星不稳定的结肠癌细胞具有特异性的抑制作用,在一个比较小的剂量时即能达到比较高的肿瘤抑制率,其在体对于肿瘤治疗的效果如何目前尚无报导。许多研究表明,冬凌草甲素具有抗肿瘤和抗基因突变的作用[12-13]。本研究发现冬凌草甲素对LOVO细胞有抑制作用,且抑制率可以达到 80%以上,对LOVO细胞的作用随着作用时间延长而增加、随作用剂量的增加而增加,具有时间和剂量依赖特点。当其浓度超过20 μ g/mL后其抑制率不再随浓度的上升而提高,且经过处理后LOVO细胞仍呈微卫星不稳定状态,故冬凌草甲素不能抑制错配修复基因缺失的结直肠癌的基因突变的发生,但是,冬凌草甲素是怎样抑制错配修复基因缺失的结直肠癌细胞的生长,其具体机制需做进一步的研究。

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