发酵法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究进展

陈 原，肖冬光

(天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室，天津300457)

发酵法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究进展

陈 原，肖冬光*

(天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室，天津300457)

S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物，广泛存在于动植物和微生物体内，参与40多种生化反应，临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法。详细阐述了SAM的微生物发酵制备方法的国内外研究现状。

S-腺苷-L-甲硫氨酸，微生物发酵法，研究进展

1 诱变菌株发酵生产SAM

1.1 筛选高产菌株

根据shiozaki等人［6］的研究发现，清酒酵母相对于其它酵母属菌株能积累更多的SAM。因此国内北京化工大学［8］、西南大学［9］都将清酒酵母作为诱变出发菌株。对于诱变手段，有采用紫外诱变、γ射线诱变、紫外氯化锂复合诱变、NTG诱变，还有采用航空诱变。诱变筛子目前采用DL-乙硫氨酸［10-12］和制霉菌素［10，13］较多。初筛方法有采用紫外分光光度法，还有采用纸层析法。复筛方法通常为HPLC法。所得的诱变菌株相对于出发菌株都有不同程度的提高。

国外对于诱变筛选高产菌报道相对较少。其中K.P.Mincheva等［11］通过N-甲基-N-硝基-N'-亚硝基胍(NTG)诱变，DL-乙硫氨酸抗性筛选得到一株富含SAM的乳糖利用型的克鲁维酵母AM-65。可发酵乳清生产SAM。Petra.C.Heiland和Frank.F.Hill［12］通过紫外诱变，DL-乙硫氨酸抗性筛选得到一株富含SAM的面包酵母突变株325。

1.2 培养基及培养条件的优化

国内北京化工大学主要做高密度发酵工艺的优化，考察了补糖中添加磷酸氢二铵、谷氨酸钠、三磷酸腺苷二钠来提高酿酒酵母发酵后期的稳定性，发现在发酵34h左右，菌体干重超过100g/L后，开始添加50g L-甲硫氨酸，并在补糖中加入10g/L三磷酸腺苷二钠，发酵65.7h，SAM产量达到了17.1g/L［14］。

另外浙江大学考察了利用废啤酒酵母或酿酒酵母ZJUS1来同时生产SAM和谷胱甘肽［15］。

国外 K.P.Mincheva等［16］对乳清培养基进行优化，得到最佳的乳清培养基为含4g/L乳糖，3.1g/L硫酸铵，12.7g/L玉米浸出液，4.6g/L的L-甲硫氨酸的脱蛋白乳清液。培养20h后，细胞干重为14.2g/L。SAM的含量在26h后达到最大为90mg/g。因为其他变量(pH，溶氧浓度等)可能也是SAM生产的关键，因此K.P.Mincheva等［17］又对发酵条件进行优化，得到最佳发酵条件为 28.5℃，pH为 5.3，转数为270r/min。在最佳条件下培养20h，所得SAM产量为1.55g/L。

S.Shiozaki等［18］对培养基进行了优化，得到最适培养基为10%蔗糖，1.8%尿素，1%酵母提取物，0.75%～1.5%L-甲硫氨酸。另外在培养基中添加甘氨酸、生物素和CaCl2都有利于SAM的积累。在最优条件下进行发酵，所得SAM的产量为10.8g/L，含量为260mg/g。S.Shiozaki等［19］还对培养条件进行了研究，发现在转速为500r/min或蔗糖流加时S.sake K-6的生长速率相对于转速为300r/min或乙醇流加时要大，而在转速为500r/min或蔗糖流加时SAM的含量相对于转速为300r/min或乙醇流加时要小。

1.3 分离纯化及稳定性盐的制备

由于SAM是胞内物质，要得到产物SAM，首先必需破碎酵母细胞，将其释放出来，然后利用离心或过滤的方法将上清液和细胞碎片进行分离。国内曾俊华等［20］考察了不同细胞破碎方法对酵母释放S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的影响，结果表明用乙酸乙酯处理细胞，再利用0.35mol/L硫酸破壁可以使90%以上的SAM从酵母中释放出来。

由于破壁分离所得的上清液中存在着其它杂质，必需将它们除去。一般采用两种方法，一种是用选择性沉淀剂对SAM进行选择性沉淀。另一种是用阳离子交换树脂进行吸附，然后对其进行洗脱即可得到SAM产物。

Shiozaki等［21］分离提取SAM的方法为首先对酵母进行破碎，采用冷冻融化进行破碎，所得的上清液首先通过安伯来特IRA-45(OH-)，过滤除去树脂后的滤液再过安伯来特XAD-2，直接通过树脂的部分再过安伯来特IRC-50(H-)，此柱用0.005N硫酸进行洗脱，直到洗脱液在258nm处的吸光度值小于0.2，再用0.1mol/L硫酸进行洗脱，将SAM洗脱下来。在洗脱液中加入冰丙酮和甲醇混合液(75∶25，v/v)，通过离心收集沉淀。沉淀用冰丙酮洗涤然后溶解在水中，最后冻干即得产物。

在分离纯化过程中由于SAM不稳定，会发生分解，因此需要降低pH和温度抑制其分解，此外还需将其制备成盐。赵晓星［22］对稳定性盐的制备进行了研究，分别制取了硫酸盐，对甲苯磺酸硫酸双盐以及1，4-丁二磺酸二钠盐。

2 重组菌发酵生产SAM

由于诱变育种的不定向性，因此通过基因工程和代谢工程方法提高SAM产量成为研究热点。对于SAM生产菌的遗传改造主要有以下5种途径。

2.1 高效表达腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2

通过高效表达无产物抑制现象的酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2可以提高细胞内总的SAM合成酶的活性，从而提高SAM的产量。Zhang等［23］将来源于酿酒酵母的SAM合成酶基因SAM2置于AOX1启动子的下，构成表达质粒，质粒载体为pPIC9K(α信号肽被切除)，并转化入毕赤酵母GS115，在摇瓶中考察了甲醇添加量和细胞密度对SAM产量的影响。当添加2%甲醇和细胞密度为30.90g干细胞/L时，SAM产量最高为1.29g/L。此外又考察了发酵过程中NH+4浓度对SAM产量的影响，当浓度为 450mmol/L时，生产率最大为0.248g/L，同时在非常短的诱导时间(47h)，3.7L发酵罐内SAM的产量达到11.63g/L［24］。由于AOX1启动子调控SAM合成酶表达时，在甲醇诱导期会发生胞内ATP供应不足。因此HU等［25］尝试采用甲醇和甘油交替补料，但甘油会抑制SAM合成酶表达。为实现同时保持SAM合成酶的表达和补入甘油提高胞内ATP水平，吕中原等［26］设计同时利用 AOX1和GAP启动子在同一重组菌内调控 SAM2表达的策略。

国外Eun-Sil Choi等［27］对工业菌株S.cerevisiae sake K6进行紫外诱变得到一株亮氨酸缺陷型菌株K6-1，该突变株的生长速率和SAM的产量与出发菌株相当。使用亮氨酸缺陷作为遗传标记，在突变株中过量表达SAM2，提高了所得重组菌的SAM产量。Sang-Woo Lee等［28］对上述亮氨酸缺陷型菌株又进行了基因改造。将SAM2和ERC1基因片段导入，使S. cerevisiae sake K6的SAM产量进一步提高。SAM的含量达到了细胞干重的一半。Shiomi等［29］将乙硫氨酸抗性基因转入细胞内，重组菌的DL-乙硫氨酸抗性明显增加而且SAM的产量也明显增加。随后对此抗性基因的限制性酶切图谱进行分析发现，此基因可能为SAM2。Shiomi等［30］为了进一步提高SAM的产量，将此乙硫氨酸抗性基因整合到酵母染色体中，发现SAM的产量是乙硫氨酸抗性基因整合在染色体外多拷贝质粒时的两倍。

2.2 切断SAM转化为半胱氨酸的途径

通过敲除胱硫醚β-合成酶(CBS)基因，可切断SAM转化为半胱氨酸的途径，从而增加细胞内SAM的积累。He等［31］对毕赤酵母GS115进行了以下3种方式改造，一种为导入腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2，所得重组菌株Gsam的SAM产量是原始菌的20倍，另一种为敲除胱硫醚合成酶基因CBS，所得重组菌的SAM产量为原始菌的两倍，还有一种将上述两种策略进行结合，所得重组菌Gsam-cbs的SAM产量比原始菌株提高了56倍，首次报道了基因导入和敲除在SAM生产中的协同效应。重组菌Gsamcbs在摇瓶中SAM最高产量为3.6g/L，在5L发酵罐中SAM最高产量达到13.5g/L。邓娟娟［32］又对该菌种的发酵工艺进行了系统的研究和优化，在5L发酵罐中SAM平均产量达到了15g/L，将发酵规模扩大到20L，并对工艺做了相关改进，SAM产量达到了22g/L左右。

2.3 解除SAM对甲叉四氢叶酸还原酶的反馈抑制

酿酒酵母的甲叉四氢叶酸(MTHFR)有2个同功酶Met12p和Met13p，其中Met13p同功酶是其活性的主要来源［33］，催化5，10-甲叉四氢叶酸生成5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸和高半胱氨酸合成甲硫氨酸，而甲硫氨酸是SAM合成的前体。Sanja Roje等［34］使用代谢工程的方法在酿酒酵母中证明了MTHFR在体内受SAM的抑制。通过构建了一个由Met13p的N端催化部位以及拟南芥MTHFR的C端调控部分构成的嵌合MTHFR(Chimera-1)取代酿酒酵母原有的MTHFR，结果显示构建的重组酵母SCY4积累的SAM以及甲硫氨酸分别比野生酵母提高了140倍和7倍。说明SAM在体内对MTHFR有反馈抑制的作用。同时也证明了解除SAM对MTHFR反馈抑制来提高SAM产量的可行性。随后又发现SCY4在含甘氨酸和甲酸盐的培养基中生长时，SAM高量积累，但当添加物换成丝氨酸时，SAM不再高量积累［35］。

2.4 切断SAM生成麦角固醇的途径

通过敲除麦角固醇合成过程中有关的酶基因，来阻断SAM的去路，从而提高SAM的产量。Megumi Shobayashi等［13］做了相关的研究，首先对出发菌株S.cerevisiae K-9和X2180-1进行紫外诱变，用制霉菌素作为筛子进行筛选，以期筛选到SAM产量高的突变株。结果筛选到的高产SAM的突变株其SAM的产量是出发菌株的1.7～5.5倍，同时麦角固醇的含量减少。对K-9的两株突变株进行NMR和GC-MS分析显示，这两株突变株的突变位置在erg4，因此推测erg4的突变可以使酿酒酵母的SAM产量提高。为了证明这一点，分析了敲除erg4基因的酵母菌株及其出发菌株的SAM产量和麦角固醇的含量，结果证明了erg4缺陷的突变株可以高产SAM。因此通过敲除麦角固醇合成过程中的有关基因可提高SAM产量。

2.5 对腺苷甲硫氨酸合成酶进行 DNA shuffling改造

采用DNA shuffling技术，提高腺苷甲硫氨酸合成酶的活性，从而提高SAM的产量。国内Hu等［36］采用此技术对大肠杆菌、酿酒酵母和链霉菌的腺苷甲硫氨酸合成酶进行重新洗牌得到重组腺苷甲硫氨酸合成酶，将其转入GS115。筛选到两株高腺苷甲硫氨酸酶活性和高产SAM的重组菌。对最佳的重组菌GS115/DS56进行500L发酵，产量为6.14g/L。随后又对此菌株的L-甲硫氨酸补料策略进行优化［37］。

3 结论

随着SAM在医药工业中的广泛应用及其需求量的不断增加，建立廉价有效的生产方法已是迫在眉睫。首先在菌种选育方面，由于前体物L-甲硫氨酸的价格昂贵，所以可以考虑通过基因工程的方法构建可利用价格低廉的前体物来生产SAM的菌株，其次在发酵方面，可尝试开发低廉的原料作为发酵培养基，同时对于高密度发酵的补料策略也可以进行进一步的研究，缩短其发酵时间，提高前体物的转化率，最后在分离纯化及稳定性盐的制备方面，应减少分离纯化步骤，从而减少其制备过程中的损失，同时开发更加安全稳定的盐。

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Research progress in S-adenosyl-L-methionine producing with fermentation

CHEN Yuan，XIAO Dong-guang*
(Tianjin University of Science and Technology，College of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin 300457，China)

S-adenosyl-L-methionine(SAM)was a metabolite that results from the combination of methionine and ATP.It widely existed in plants，animals，microorganisms and participates in more than 40 kinds’biochemical reactions.It had remarkable curative effect on liver disease，depression，arthritis and many other diseases.The preparation methods of SAM included chemical synthesis，microbial fermentation，enzymatic synthesis in vitro and whole-cell catalytic method.It elaborated on the current status of microbial fermentation at home and abroad.

S-adenosyl-L-methionine;microbial fermentation;research progress

TS201.2

A

1002-0306(2011)09-0435-04

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-LMethionine，SAM)是广泛存在于生物体内、具有重要生理活性的一种代谢中间体，对于肝病［1］、抑郁症［2］、关节炎［3］等疾病具有显著疗效。1999年美国FDA批准SAM作为保健品上市，现在已经成为一种畅销的保健品。我国肝炎、关节炎以及抑郁症患者众多，对SAM的需求量较大。但目前国内仅海正药业一家可以生产SAM。SAM的生产方法有化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法［4］。工业化生产SAM的主要方法是微生物发酵法。本文详细阐述了微生物发酵法的国内外研究现状。微生物发酵法是基于酵母属菌株含有液泡，相对于其它微生物具有较强的积累SAM能力［5-7］，因此可利用这些菌株在含有L-甲硫氨酸的培养基中培养，积累较高浓度的SAM。通过这些酵母菌株的大规模发酵及后期的提取精制，可获得具有生物活性的SAM。根据所采用的菌株，可将微生物发酵法分为两类:一类是诱变菌株的微生物发酵，另一类是重组菌株的微生物发酵。

2010-09-13 *通讯联系人

陈原(1987-)，男，硕士研究生，研究方向:微生物发酵。