配适体在食品有害物检测中的应用潜力

罗剑鸣，彭喜春，* ，吴希阳，赖毅东

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632;2.东莞市质量计量监督检测所，广东东莞523120)

配适体在食品有害物检测中的应用潜力

罗剑鸣1，彭喜春1，*，吴希阳1，赖毅东2

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632;2.东莞市质量计量监督检测所，广东东莞523120)

配适体是由指数富集配体系统进化技术筛选出来的一段具有功能性的单链寡核苷酸序列，具有高效与靶目标分子特异性结合的特性。配适体在许多领域研究及应用逐渐展开，本文对配适体在食品安全检测领域方面的应用潜力进行了分析和展望。

配适体，三甲烷类化学染料，重金属，真菌毒素，抗生素

寡核苷酸配适体为一段具有功能性单链的寡核苷酸序列，包括了DNA和RNA，能与相应的靶目标专一性结合［1］。而这种序列是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX技术)，从随机寡核苷酸库中筛选得到［2］。这种体外化学合成的随机寡核苷酸库中每条核苷酸链的两端为固定碱基序列，中间是随机碱基序列，由于这种随机序列，决定了库中每条链自然形成的空间构象即二级结构，具有多样性，决定了库中潜在地存在能与各种蛋白和低分子靶物质有亲和力的核酸配体，因而从理论上，自然界中绝大多数物质都能分离出相应的配适体。

1 配适体的筛选(SELEX技术)

目前对配适体的应用均利用了配适体能与多种靶分子特异性结合，并且结合紧密，效率高的优点。这些优点能在应用中体现，主要是因为配适体要经历一个筛选的过程。在体外合成的寡核苷酸库中挑选出能与靶分子紧密结合的、理想的配适体，确保了配适体结合的特异性;而指数富集不仅能扩增配适体的数量，并且富集后的筛选进一步确保了配适体的特异性;之后对配适体结合位点的研究改良，能令配适体对靶目标的结合更加紧密，从而确保其高效性。

1.1 配适体筛选的技术步骤

用于配适体筛选的SELEX技术普遍的可以分为5个主要的步骤的循环、结合、分离、洗脱、扩增和调节。这种体外筛选和酶促扩增的不断循环模仿了一种达尔文式的选择过程，最终能从众多的核酸分子中筛选出具有最优结构并能与目标分子特异性结合的配适体［3］。

典型的SELEX过程的第一步是化学合成随机的DNA寡核苷酸文库，文库是由两端固定序列(约18～21碱基)及20～80个中间随机碱基构成，通常含有大约1013～1015个不同的单链DNA片段［4］。将目标分子放入文库内的DNA中，使目标分子和对应的DNA片段结合，形成络合物。分离过程中，紧密结合的络合物会与未结合的片段，或者结合不强的片段分离。分离步骤在配适体筛选过程中是最重要的一环，因为这步能影响到后面对配适体结合特性的分析。经过分离后，络合物经洗脱，使目标分子与DNA片段分离，随后DNA片段将用PCR技术进行体外扩增。扩增后的双链DNA产物需要经由一定的处理，从中选出对应的单链DNA寡核苷酸序列进行纯化、富集，以便下一轮的SELEX筛选。不断地重复循环筛选/扩增，最终便会筛选出能够与目标分子高结合，并能特异性结合的寡核苷酸序列，即配适体。在最后一个循环，以扩增这个步骤作为终点，所得到配适体就可以用于研究改良其结合位点和结合特性，以便确保其高效性和特异性［5］。

1.2 配适体的筛选及应用发展史

1990年，Tuerk和Gold研究了T4噬菌体的DNA聚合酶以及mRNA的相互作用。RNA寡核苷酸序列是从组合核苷酸库里筛选出的，而且实验证明其能与非核苷酸序列(DNA聚合酶)特异性的紧密结合，整个筛选的过程被称作 SELEX技术［6］。同年，Ellington和Szostak运用类似的技术从随机的RNA库中分离出能与特定的目标分子特异性结合的RNA序列，这种RNA序列能折叠成稳定的三维空间结构，因此形成了能与目标分子结合的结合位点，并将这些序列命名为配适体(aptamer)［7］。两年后，从随机的DNA序列库也成功分离出了一段能与靶目标特异性紧密结合的单链DNA序列［8］。随后，SELEX逐渐建立并且不断发展。

目前，配适体主要应用在医学领域以及电化学检测方面。配适体在医学领域上的研究，主要为药物开发，例如作为某些疾病的抑制剂，此外，临床诊断也是研究的主要内容。作为疾病的抑制剂，其原理主要是配适体能与一些致病的受体结合，从而使疾病得到控制。如Cohen和Forzan等人分析研究了配适体与引起艾滋病的HIV病毒的相互作用，获得了一个能够与HIV－1 R5株病毒结合的配适体，可中和HIV病毒的感染［9］。Charlton等人在临床诊断方面对配适体的应用进了研究，并提出了一种对炎症诊断性成像的新方法［10］。在电化学检测的研究当中，配适体被应用于生物传感器的开发研制当中［5，11］。随着人们对配适体巨大应用潜力的认识，配适体近年来被应用到更多领域。

2 配适体技术在食品有害物检测中的应用潜力

目前，引起食品安全性的物质的检测大多需要昂贵的设备或者方法的假阳性率高，因此开发新的检测方法具有极大的市场潜力。从理论上配适体能应用于检测所有的靶分子，但在食品领域中，尤以在食品中有害物质检测分析中的应用甚为少见，但是不可否认该技术将在食品安全检测中具有极大的应用潜力。

2.1 配适体与三甲烷类化学染料

三甲烷类化学染料中，最为熟知的是孔雀石绿，它作为驱虫剂广泛应用于水产养殖业中。孔雀石绿能够控制真菌对水产品如鱼类的侵害，同时也能防止原生动物的感染，控制一些由蠕虫肠虫所引起的疾病。但是，孔雀石绿是致癌剂、致突变剂、致畸剂，能够引起染色体断裂以及具有呼吸毒性，毒性随着暴露时间的增加而增大［12］。目前用于孔雀石绿检测的方法有高效液相色谱荧光法和酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒法。

利用SELEX技术筛选出能够特异性结合孔雀石绿的配适体代替抗体，可以制作成孔雀石绿检测试剂盒。这种利用配适体的试剂盒没有交叉反应，能够满足检测灵敏度高的要求，也无需制备抗体，将DNA或RNA作为识别分子，易合成，成本低，易于标准化和自动化，因此有很大的开发潜力。Grate等人筛选出了能够与孔雀石绿结合的配适体的碱基序列，为试剂盒的开发提供了基础［13］。对于其他有可能用于有关食品领域的三甲烷类化学染料，也可以用相类似的方法进行研究。

2.2 配适体与重金属

工业排放的汞、镉、铅等重金属会对土壤，河流等造成污染，然后在农作物、海产鱼类等食品原材料中蓄积而进入到人类的食物链中，引起人的急慢性食物中毒。食物中最为常见的污染包括汞、镉、铅还有砷等。在 GB/T 20380.1－2006及 GB/T 20380.2－2006中，用原子吸收光谱法分别对砷和汞进行测定，在 GB/T 20380.3－2006及 GB/T 20380.4－2006中，用电热原子光谱对铅和镉进行检测。

Ciesiolka等人对配适体和金属离子的结合进行了研究。他们在有50个随机位点的核糖寡核苷酸库中挑选出了一种能与二价锌离子结合的RNA配适体。这种配适体能与目标分子结合的部分，是一个能随机的结合二价离子的位点。将配适体进行适度的修饰，使结合位点正好只能容纳锌离子的大小，这样便能从中筛选得到目标配适体［14］。其后，Hofmann等人则对能与二价离子结合的配适体进行更深入的研究，发现结合部位的不对称嘌呤数量丰富、有G－A交互作用的RNA，就会显示出能与二价离子结合的特异性，并挑选出了能与Ni2+结合的配适体［15］。这些研究给配适体作为重金属检测提供了研究思路以及基础，使开发重金属配适体检测试剂盒成为了可能。

2.3 配适体与真菌毒素

真菌毒素通常指的是作为次级代谢产物，由一些真菌类微生物所产生的，分子量相对较少(分子量少于700)，有毒的化学物质。农作物被真菌毒素感染，能引起一系列的急性或慢性中毒，其中慢性中毒包括了致癌，对肝脏造成损伤，致使免疫力低下等［16］。

黄曲霉毒素属于真菌毒素的一类，通常由黄曲霉产生。毒素多数出现在谷物、花生等农作物以及由这些作物加工而成的产品当中，有时甚至在水产品及畜产品中也有可能发生黄曲霉毒素的残留［17］。黄曲霉毒素根据结构不同可以分成很多种，其中，以黄曲霉毒素B1的毒性最强。目前检测黄曲霉毒素B1的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、薄层色谱法、微柱分析法以及高效液相色谱法等。

尽管目前配适体筛选及应用技术研究得最多的是蛋白质类靶分子［18］，对于类似黄曲霉素这种有机小分子类的靶分子，也有不少学者进行过研究。Lauhon和Szostak利用SELEX技术，成功的在体外筛选出一种RNA配适体，这种配适体能够与核黄素特异性结合［19］;Mannironi等人在体外筛选出能与多巴胺结合的RNA配适体，并且利用与多巴胺相类似的分子与适配体结合，从而进一步的确定配适体与靶分子的结合部位［20］。Mann等人甚至筛选到一种分子量只有61.08的有机小分子——胆胺的配适体，而且筛选出的配适体与胆胺的结合力处在纳摩尔范围，显示出极高的亲和力［21］。

目前并未见有关文献提及已经筛选出可以与黄曲霉毒素特异性结合的配适体，但根据配适体筛选技术(SELEX技术)的原理，从寡核苷酸库中挑选出能与黄曲霉毒素结合的配适体是可能的。而上述研究也证明了可以在随机寡核苷酸库中筛选到与较小分子质量的有机分子特异性结合的配适体。如核黄素的分子量376.37，多巴胺分子量为153.18，这几种物质都是含苯环的小分子物质。其中核黄素与黄曲霉毒素B1的分子质量(312.27)相近。因此，筛选出能与黄曲霉毒素B1特异性结合的配适体的可能性非常大。很多其它真菌毒素也可以类似地进行研究。

2.4 配适体与抗生素

目前，由于抗生素的过度使用，由抗生素超标引起的食品质量安全问题在国内外引起了越来越多的重视。抗生素残留量的检测是世界肉类贸易中重要的技术指标和技术性壁垒之一，这一问题已成为制约我国动物产品出口的瓶颈。随着仪器设备性能的提高和检测方法的不断改进，检测标准向更高的方向发展。例如欧盟规定在动物源性食品中不得检出氯霉素残留，这意味着检测仪器的检出限就成为了标准。目前用于抗生素检测的方法有液相色谱与质谱连用检测法和酶联免疫吸附法。

近年来，国外对抗生素分子配适体的筛选做了不少研究。Berens等人筛选出了与四环素分子结合的RNA配适体，并且对配适体的结合部位作出了分析研究［22］;Wochner等人也筛选出了一种与蒽环类抗生素特异性结合的DNA配适体［23］。尽管常见的残留抗生素并未筛选出对应的配适体，但国外这些成功的筛选例子则提供了一种方法，使得筛选成为了可能。而且目前利用配适体检测食品中的有害残留还是空白，用配适体代替抗体用于酶联技术中也未见报道，因此将抗生素分子配适体用于试剂盒制作具有非常大的开发潜力。

2.5 配适体与食源性致病菌

Chen和Zhou等人则研究了配适体对肺结核致病菌——结核分歧杆菌的结合作用。该配适体(NK2)与结核分歧杆菌有高度的结合力以及特异性［24］。

这一研究同样给食源性致病菌的检测提供了一个思路，如果在筛选出来的配适体上连接一个可识别的标记分子(如生物素标记物)，则可开发出一类新的食源性致病菌的检测方法。

3 结语

理论上，利用SELEX技术能筛选出与任何靶目标分子结合的配适体。目前配适体主要应用于医学以及电化学检测方面，在食品检测中的实际应用却未有报道。由于现代食品检测技术所需要的仪器设备成本高，维护费贵，检测时间相对较长;而酶联免疫吸附法(ELISA)虽能减少成本和检测时间，但由于国内缺乏自主知识产权的产品，以及抗体制备困难，因而将配适体技术应用于食品检测中具有很大的市场价值和潜力，而且国外研究资料提供了很多筛选方法和研究思路，也为配适体在食品检测中应用提供了理论的基础。参考文献

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Potential application of aptamers in harmful substance detection in food

LUO Jian－ming1，PENG Xi－chun1，*，WU Xi－yang1，LAI Yi－dong2
(1.Department of Food Science and Engineering，College of Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China;2.Dongguan Institute of Metrology and Quality Supervision Testing，Dongguan 523120，China)

An aptamer is defined as a section of functional single－stranded oligo－nucleic sequence selected from systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)that binds to its ligands with high affinity and specificity.The research and application of aptamers in many research fields had been gradually developed.The potential application in the detection of food safety of aptamers had been analyzed and discussed.

aptamer;triarylmethane dye;heavy metal;mycotoxin;antibiotic

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0457－04

2010－06－04 *通讯联系人

罗剑鸣(1986－)，男，在读硕士研究生，研究方向:食品安全。

东莞市科技计划项目(200910810176)资助。