姜黄素诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡的实验研究

崔丽霞 马占敏

（郑州市妇幼保健院，河南郑州450012）

姜黄素（curcumin）是从传统中药姜黄中提取的一种酚性色素，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗微生物等多方面药理作用[1]。近年来，对姜黄素抗癌作用的实验研究表明，姜黄素能抑制体内外多种肿瘤细胞的生长且对多种肿瘤细胞有明显生长抑制和促凋亡的作用[2]，如姜黄素呈时间及浓度依赖性抑制肿瘤细胞HL-60、K562的增殖，姜黄素也可诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡，且毒副作用小。目前应用姜黄素对急性单核细胞白血病的药理研究鲜见报道。本实验通过急性单核细胞白血病株THP-1，探讨姜黄素对THP-1可能的作用机制，为临床应用于白血病的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人白血病细胞THP-1购自中国科学院细胞库；姜黄素购自国药集团化学试剂有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国Becton Dickinson Biosciences公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德；Caspase-3分光光度试剂盒购自南京凯基生物科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将THP-1于RPMI1640培养基37℃、5%CO2的培养箱中培养，每48～72h传代1次，长至对数生长期。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，实验组加入姜黄素，使其终浓度分别为1、5、10、15μmol/L，相同条件下培养24h，每个浓度均设3个复孔，同时设阴性对照组。24h后收集细胞，细胞浓度为（1×106）个/mL，4℃预冷的PBS洗涤两次。取100μL的细胞悬液，加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI，混匀后室温避光孵育上机检测。

1.2.3 免疫组化检测NF-κB与Caspase-3蛋白 THP-1细胞（1×106个/mL）接种于放有盖玻片的6孔培养板，按照1.2.2加入不同浓度的姜黄素，24h后取出盖玻片，PBS冲洗3遍，多聚甲醛固定，按SABC免疫酶标试剂盒方法进行，每个浓度重复3遍。细胞中呈现棕褐色颗粒者为阳性细胞，并采用Biosens Digital Imaging System医学图像分析系统进行阳性区平均光密度测量。

1.2.4 Caspase-3活性测定 按试剂盒说明用酶标仪测定A405值。

1.3 统计学处理

采用SPSS15.0统计软件进行分析，所有原始数据均进行正态分布、方差齐性检验。实验数据以（±s）表示，多样本均数比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对THP-1细胞凋亡率的影响

流式细胞检测结果显示：1、5、10、15μmol/L姜黄素作用24h后的凋亡率分别为（2.341±0.221）%、（10.841±0.789）%、（18.126±0.627）%、（26.418±0.519）%；与对照组（1.233± 0.118）%相比，除1μmol/L组无显著性（P＞0.05）外，各组差异有显著性（P＜0.01），见图1，表明姜黄素诱导的THP-1细胞凋亡具有量效关系。

图1 姜黄素对k562细胞凋亡率的影响

2.2 姜黄素对THP-1细胞NF-κB与Caspase-3蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，1、5、10、15μmol/L的姜黄素作用24h后，NF-κB蛋白水平逐渐降低，而Caspase-3蛋白水平逐渐升高，而且统计学分析NF-κB与Caspase-3的表达量呈负相关，系数为-0.823。见表1。

表1 姜黄素处理24h后NF-κB与Caspase-3表达水平的改变（±s，n=3）

表1 姜黄素处理24h后NF-κB与Caspase-3表达水平的改变（±s，n=3）

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别 NF-κB Caspase-3对照组 188.452±2.358 110.214±5.720 1μmol/L 185.926±4.748 116.946±5.250 5μmol/L 151.662±9.216* 132.556±4.459* 10μmol/L 139.104±7.757* 149.466±5.266* 15μmol/L 126.858±3.966* 166.902±6.238*

2.3 姜黄素活化Caspase-3

1、5、10、15μmol/L姜黄素作用24h后的Caspase-3活性值分别为（0.072±0.038）%、（0.129±0.036）%、（0.179±0.055）%、（0.233±0.059）%；与对照组（0.058±0.049）%相比，除1μmol/L组无显著性（P＞0.05）外，各组差异有显著性（P＜0.01）。

3 讨论

急性白血病是造血系统的恶性增生性疾病，是一以异常造血细胞的恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血细胞减少为特征的造血系统肿瘤。在我国，小儿的恶性肿瘤中以白血病发病率最高，其中急性髓细胞白血病（AML）占小儿急性白血病的20%～40%。虽然新的治疗手段不断出现，白血病的生存率有明显提高，但复发以及耐药仍然是临床医生面临的十分棘手的问题。大量的研究提示，NF-κB参与了白血病的发生、发展，NF-κB的高表达与促进白血病细胞生长、抗凋亡、耐药密切相关[3]，已经成为白血病治疗的一个潜在靶点。

近年的研究表明，姜黄素通过调控抑癌基因、癌基因及其蛋白表达，诱导细胞周期阻滞及调控细胞凋亡信号来实现其抗肿瘤作用。Anuchapreeda等[4]发现用姜黄素可以降低耐药肿瘤细胞中的Pgp的含量，增加化疗药物对肿瘤细胞作用的敏感性。

近来的研究发现，姜黄素抑制乳腺癌干细胞的自我更新，但不会造成已分化的细胞毒性，这使姜黄素可能成为潜在的癌症预防剂。在姜黄素治疗胰腺癌的二期临床试验中，病人对姜黄素耐受性良好，显著缩小了肿瘤体积，具有良好的的生物活性[5]，因此姜黄素具有价格低、毒性小、获取方便和良好的抗肿瘤效果等优点，已成为极受重视的一种抗肿瘤新药。

本实验显示，姜黄素可有效诱导THP-1细胞凋亡，而且具有一定的量效性。免疫组织化学染色的结果也证实了姜黄素可诱导白血病细胞发生凋亡，其可能的机制是姜黄素降低了NF-κB的表达，通过阻断NF-κB信号传导通路而使白血病细胞凋亡增加。

Caspase-3（半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白）家族成员大多数是凋亡的启动子或效应子，在细胞凋亡中发挥着重要作用。自1992年发现第一个Caspase开始，迄今已经发现了14种。Caspase-3是凋亡过程中最重要的效应酶之一[6]，被称为“刽子手”，一旦它被激活，通过一系列细胞内部的蛋白变化，使细胞发生凋亡。本研究中也发现姜黄素对Caspase-3蛋白表达有上调作用，并呈浓度依赖性，考虑是其诱导凋亡的机制之一。

姜黄素几乎无任何毒副作用，作为一种食用色素和调味剂被广泛食用，同时也用于治疗各种炎症和其它疾病，是一种具有广泛应用前景的新药，美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药。因此，开展其抗癌作用及机理的研究有十分重要的理论意义和实用价值。

[1]Holt PR，Katz S，Kirshoff R.Curcumin therapy in inflammatory bowel disease：a pilot study[J].Dig Dis Sci，2005，50：2191-2193.

[2]Aggarwal BB，Banerjee S，Bharadwaj U，et al.Curcumin induces the degradation of cyclin E expression through ubiquitin-dependent pathway and up-regulates cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 in multiple human tumor cell lines[J].Biochem Pharmacol，2007，73（7）：1024-1032.

[3]Karin M，Cao Y，Greten FR，et al.NF-kappaB in cancer：from in nocent bystander to major culprit[J].Nat Rev Cancer，2002，2（4）：301-310.

[4]Anuchapreeda S，Thanarattanakorn P，Sittipreechacharn S，et al.Inhibitory effect of curcumin on MDR1 gene expression in patient leukemic cells[J].Arch Pharm Res，2006，29（10）：866-873.

[5]Kakarala M，Brenner DE，Korkaya H，et al.Targeting breast stem cells with the cancer preventive compounds curcumin and piperine[J]. Breast Cancer Res Treat，2010，122（3）：777-785.

[6]Lin CL，Zhang ZX，Xu YJ，et al.Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle cells apoptosis[J].Chin Med J，2005，118（1）：20-26.