磁性纳米粒子在生物学及医学领域的应用

郭祖鹏，郭 莉，师存杰，焉海波

(青海大学化工学院，青海 西宁 810016)

随着纳米科学的发展，纳米材料在生物学及医学等领域展示出了广阔的应用前景[1]。在众多的纳米材料中，磁性纳米粒子由于其超微尺寸，表现出许多不同于常规磁性材料的特性，如超顺磁性、高矫顽力、小尺寸效应、量子隧道效应、居里温度降低等特性[2]，在生物分离、生物检测[3]、靶向药物输送[4]、磁共振成像[5]、肿瘤磁感应热疗[6]等生物学及医学领域得到越来越多的应用，逐渐成为研究热点。作者在此综述了近年来磁性纳米粒子在生物学以及医学领域的研究进展。

1 生物分离

生物分离是指利用功能化磁性纳米粒子的表面配体(或受体)与受体(或配体)之间的特异性相互作用(如抗原-抗体作用、亲和素-生物素作用等)来实现对靶向性生物目标的快速分离。传统的分离技术如沉淀、离心等，步骤繁杂、耗时长、收率低，接触有毒试剂，很难实现自动化操作。而磁分离技术具有快速、简便的特点，能够高效、可靠地捕获特定的蛋白质或其它生物大分子。基于磁性纳米粒子的超顺磁性，纳米粒子在外加磁场作用下被磁化，然而一旦去掉磁场，立即重新分散于溶液中。通常磁分离技术主要包括以下两个步骤：(1)将要研究的生物实体标记于磁性粒子上；(2)利用磁性液体分离设备将被标记的生物实体分离出来。目前，磁分离方法已经拓展到对细胞、蛋白质和核酸(DNA，RNA)等多种生物目标的分离和纯化。

李梅基等[7]采用化学共沉淀法合成纳米粒子Fe3O4磁核，以壳聚糖为包裹材料，采用乳化交联法制备了具有核-壳结构的磁性高分子微球——壳聚糖磁性微球，再耦联肝素配基得到了一种新型亲和磁性微球，通过实验考察了该亲和磁性微球对凝血酶的分离纯化性能，并与传统的DEAE离子交换色谱法进行了比较。结果表明，所得亲和磁性微球形状规整、粒径分布较窄，粒径在50 nm左右，对凝血酶一步吸附纯化获得了比活1879.71 U·mg-1的酶、得率85%、纯化倍数11.057，而传统柱层析法得率72%、纯化倍数仅5.33。

孙文通等[8]采用层层自组装技术在磁性纳米粒子表面上修饰了聚天冬氨酸和聚乙二胺。磁性纳米粒子表面的电荷可以通过聚乙二胺溶液的pH值调控，其等电点随聚乙二胺溶液pH值的减小而减小。双层修饰的磁性纳米粒子与蛋白质的作用主要是静电作用，因此具有不同表面电荷的磁性纳米粒子可选择性地吸附蛋白质。

Bromberg等[9]成功合成了经聚乙烯亚胺和聚六亚甲基双胍盐酸盐表面修饰的磁性纳米复合粒子。分析测试结果显示，这种复合粒子能够在pH值≤10的水中稳定存在，并能捕获各种细菌的DNA分子。同时，可通过外加磁场分离这种复合粒子。此外，这种复合粒子毒性很小。Bromberg等[10]还合成了磁性金属Co纳米粒子，以聚六亚甲基双胍盐酸盐对其进行表面修饰，得到的复合磁性纳米粒子对大肠杆菌中的双链DNA具有很高的捕获能力，且吸附能力随着粒子粒径的减小而增大。

2 生物检测

磁性纳米粒子由于其较小的尺寸、较高的反应活性、优异的磁导向性以及这些性质的可调控性，在蛋白质、核酸等生物分子检测方面受到广泛关注，可以利用其建立新的检测方法以改善目前方法所存在的缺陷，具有良好的应用前景。

李智勇等[11]建立了一种板式磁颗粒化学发光免疫分析方法并将其用于人血清中癌胚抗原(CEA)的测定，该方法利用HRP标记的CEA抗体以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CEA抗体与CEA抗原在微孔板中进行夹心反应，以抗FITC抗体包被的磁性微粒子溶液作为分离固相，利用一个适用于微孔板的特殊磁性分离器进行分离，最后加入鲁米诺和H2O2底物进行发光反应。该方法采用微孔板代替透明管作为反应容器，磁颗粒作为分离固相在微孔里与免疫试剂反应，提前用BSA将微孔板封闭，结合了微孔板作为反应容器以及磁颗粒分离体系的优点，很好地解决了管式磁颗粒方法非特异性吸附强以及包被板方法线性范围小的局限性，同时避免了管间差异以及包被不均问题。用该方法对人血清中的CEA在0～250 ng·mL-1浓度范围进行了测定，检测灵敏度为0.57 ng·mL-1，批内和批间变异分别小于7%和11%。与市售CLIA试剂盒测定结果进行比对，两者显示了很好的相关性。

李智洋等[12]制备了兔抗大肠杆菌E.coliO157：H7的免疫磁性纳米粒子，富集病原菌后与鼠抗E.coliO157：H7的单克隆抗体形成双抗夹心，采用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG与单抗结合，加入碱性磷酸酶的化学发光底物试剂3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-羟基)苯-1，2-二氧杂环丁烷磷酸检测化学发光。考察了底物缓冲溶液、碱性磷酸酶浓度对化学发光强度的影响，比较了NaBH4和甘氨酸对免疫磁珠剩余活性醛基的封闭效果以及该方法检测E.coliO157：H7的特异性和敏感性。结果表明，碱性磷酸酶与底物在c缓冲溶液中反应的化学发光强度最高，碱性磷酸酶浓度决定了化学发光的强度和持续时间，NaBH4对活性醛基的封闭效果优于甘氨酸。以D群宋内氏志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌及E.coliTop10f′为对照的比较实验显示，该检测方法具有良好的特异性，以1 mL为菌液检测体积时对E.coliO157：H7的检测灵敏度为103 cell·mL-1，检测时间约为3 h。该方法适用于对多样本进行筛查。

郑国金等[13]以待测尿液中的雌三醇、辣根过氧化物酶标记的雌三醇与FITC标记的兔抗雌三醇抗体在均相体系中发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁性微粒子，反应生成物结合在磁性微粒子上，在磁场中经分离、洗涤后加入发光底物，检测发光强度(RLU)，测定尿液中雌三醇的含量。通过优化检测条件，建立了磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人尿液中雌三醇的方法，并对正常男性、女性和孕妇的尿液中雌三醇含量进行了测定。结果表明，该方法的线性范围为1～100 μg·L-1，检出限为0.25 μg·L-1，具有很高的灵敏度;批内相对标准偏差小于14%；批间相对标准偏差小于7%，具有良好的稳定性和重现性。

Song等[14]成功地将连接有单克隆抗体的荧光-磁性-细胞靶向多功能的纳米粒子用于白血病细胞和前列腺癌细胞的富集和检测。该多功能纳米粒子对两种癌细胞的捕获效率分别为96%和97%，对微量癌细胞的灵敏度也很高，可达到0.01%，而且测试分析前不需要任何预处理。

3 靶向药物输送

磁靶向药物输送系统是近些年发展起来的一种新型靶向药物输送系统，特别是具有超顺磁性的纳米粒子在药物输送系统中具有显著的优点：载药磁性纳米粒子可以通过外加磁场准确地靶向病灶部位，在提高靶区药物浓度的同时减轻了对正常组织的损伤，从而降低其生理毒性，提高药效；可以通过磁共振成像跟踪药物输送过程及其在生物体内的分布；在交变磁场的作用下，顺磁性纳米粒子吸收能量产生热能、发挥热疗效能的同时还可以控释药物。

武承林等[15]通过多步反应制备了一种多层结构、多功能的新型磁性纳米复合粒子(Fe3O4@SiO2@polymer)。该纳米复合粒子内核是磁性Fe3O4纳米粒子，SiO2包裹在Fe3O4上使其能够稳定分散并保护其不被腐蚀氧化；中间层是生物相容的聚天冬氨酸(PAsp)载药层；最外层是亲水的聚乙二醇(PEG)稳定层。磁性纳米复合粒子各层都是生物相容的，利用静电作用将抗癌药物阿霉素(DOX)负载在磁性纳米复合粒子上，DOX的释放速率在酸性条件下明显加快，这样不仅能够通过磁性作用实现药物的靶向控制释放，还能够通过pH值调节药物的释放速率。

李玉慧等[16]采用合成油酸修饰Fe3O4纳米粒子和羧甲基壳聚糖直接包埋油酸修饰的Fe3O4纳米粒子的两步合成法制备了羧甲基壳聚糖磁性纳米粒子。该磁性纳米粒子呈规则球形，粒径约10 nm；表面含羧基，具有很好的顺磁性和稳定性。考察了羧甲基壳聚糖磁性纳米粒子对阿霉素的载药量和在磷酸盐缓冲溶液中对阿霉素的缓释性能。结果表明，该磁性纳米粒子对阿霉素展示了较高的载药量(91.8 mg·g-1)，对阿霉素的缓释作用明显，有望作为治疗肿瘤的纳米磁靶向药物输送载体。

Luo等[17]采用水热法合成了粒径为200 nm左右的中空多孔Fe3O4纳米粒子，该磁性纳米粒子的饱和磁化强度高(88.7 emu·g-1)，形貌规整，孔道均一，有利于药物的存储、输送和释放，对抗癌药物紫杉醇(PXL)的载药量高达20.2%，生物相容性好，将人胚胎肾细胞HEK 293T与1000 μg·mL-1的Fe3O4纳米粒子共培养24 h，细胞存活率仍能达到80%。MTT实验表明，该磁性纳米粒子本身细胞毒性很小，负载上PXL后，能够较好地杀死肿瘤细胞。

Song等[18]采用电化学沉积法在多孔阳极氧化铝(AAO)模板内制备出直径约50 nm、长度2～5 μm的Fe纳米线，分别选用HEK293A细胞和Hela细胞为研究模型检测了Fe纳米线与细胞的相互作用，结果显示Fe纳米线确实能被细胞内吞，两种细胞在与Fe纳米线共培养72 h后存活率没有明显的下降。如果对其表面进行修饰或与介孔SiO2复合再负载抗肿瘤药物，将会成为非常有潜在应用价值的药物载体。

Mu等[19]基于含药物分子双嘧达莫的杂化乳化液滴，采用层层自组装方法成功制备了具有磁导向的pH值敏感性可控释药物输送体系。经油酸修饰的磁性Fe3O4纳米粒子和药物分子双嘧达莫直接被封装在乳化液滴内。实验发现，在108 mg·g-1的高载药量条件下，pH值为1.8时，双嘧达莫31 h后从杂化乳化液滴中释放比例几乎达到100%；而pH值为7.4时，双嘧达莫48 h后的释放比例仅为3.3%。因此，该药物输送系统具有良好的pH值敏感性和较高的药物装载量，是很有前途的药物缓释剂。

4 磁共振成像

磁共振成像技术(MRI)由于可以用来对生物体内脏器官和软组织进行无损的快速检测，已成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤最为有效的临床诊断方法之一。磁性纳米粒子在临床磁共振成像中的应用主要是指超顺磁性纳米粒子在磁共振成像中的应用。磁共振成像信号依赖于径向和横向质子的弛豫时间，正是二者之间的差异造成了不同组织在磁共振成像图像中的对比度有所不同。机体组织中水分的内在弛豫时间与其生理环境有关，因而其在病变组织中会有所改变，尽管这种变化的特异性较小，但在病变晚期，该特异性会明显增强。因此，磁共振成像非常适于对病变进行特异性诊断。利用磁共振成像造影剂可以对组织的弛豫时间加以调控，从而提高图像的信号强度和对比度。该技术力图在分子和细胞水平上将疾病特异性生物标志物可视化，其应用越来越依赖于造影剂，造影剂应用于影像引导给药要求具有生物相容性、在循环过程中保持稳定性、在血液中拥有长期的循环。在新出现的细胞和分子磁共振成像技术中，造影剂已成为关键因素。超顺磁性纳米粒子由亲水性的聚合物包覆，能赋予“隐身”的特性，改善胶体的稳定性，延长循环动力学，限制负载药物量和药物分散的快速性[20]，被广泛用作造影剂。

武新英等[21]制备了以聚乳酸(PLA)为包被材料、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽标记的超小超顺磁性氧化铁(RGD-PLA-USPIO)，并在体外和体内实验中考察了其检测肿瘤血管生成的能力。普鲁士蓝染色和透射电子显微镜证实了人脐静脉血管内皮细胞可以特异性摄取RGD-PLA-USPIO。Vx-2肿瘤模型注射RGD-PLA-USPIO后其磁共振T2加权图像的信号显著降低，而侧肌肉组织仅见轻微本底改变。表明RGD-PLA-USPIO可以有效在磁共振图像上显示活化肿瘤血管内皮整合素ανβ3的表达，未来有望在肿瘤的诊断和疗效监测方面发挥重要作用。

李芳秋等[22]将抗人精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)连接到表面包覆壳聚糖的超顺磁性氧化铁纳米粒子上，制成磁性纳米探针anti-Sp17-MNP，用作MRI阴性对比剂。将磁性纳米探针与Sp17+和Sp17-培养的肿瘤细胞共育，进行一系列体外磁共振成像实验。荷瘤小鼠尾静脉注射磁性纳米粒子，用7T磁共振仪在体成像，观察肿瘤部位的信号变化，并用普鲁士蓝染色肿瘤组织切片，观察有无铁粒子聚集。体外MRI数据显示，anti-Sp17-MNP与细胞靶向结合，并与细胞共育2 h后，Sp17+HO-8910的T2信号强度比Sp17-HepG2低2倍；anti-Sp17-MNP对肿瘤细胞的靶向作用可被重组人Sp17阻断。7T磁共振仪对动物在体肿瘤成像结果显示，感兴趣区因磁性纳米探针靶向聚集而导致信号降低，并经组织切片普鲁士蓝染色证实。研究结果表明，用anti-Sp17抗体按新的合成路线制备的纳米探针具有用作MRI对比剂进行分子成像的潜能。

乔瑞瑞等[23]采用两种不同表面修饰的Fe3O4纳米粒子作为磁共振造影剂，利用其表面羧基与具有靶向识别肿瘤表面整合素受体(Integrinαvβ3)的c(RGDyK)多肽进行耦联，制备出具有肿瘤靶向性的磁共振分子探针，并以荷人脑胶质瘤(U-87MG)裸鼠为动物模型，进行体内MRI研究。结果显示，两种纳米粒子均能够产生明显的T2造影效果，表面为聚乙二醇及油胺共同修饰的纳米粒子的最佳成像时间为注射药物后8 h，而只有聚乙二醇修饰的纳米粒子的最佳成像时间为注射药物后4 h，导致两种纳米粒子达到最佳成像效果的时间不同的原因在于其表面电荷的不同。

Zhang等[24]以PVP为稳定剂和修饰剂，采用共沉淀法合成出粒径分别为2 nm和7 nm的氧化铁纳米粒子。通过尾静脉注射的方式将该功能化纳米粒子注入实验小鼠体内，并将实验小鼠置于外加磁场30 min后对其进行MRI检测，结果显示，与对照组相比，由于外加磁场的作用，纳米粒子主要集中于靶向区域，而且注射功能化纳米粒子的小鼠在肺、肝、肾等部位的阴性对比度明显增强。这表明，该功能化氧化铁纳米粒子可以在外加磁场作用下定位于特定的靶向组织，并作为MRI诊断的阴性造影剂使用。

Tan等[25]制备了一种以Fe3O4为核、SiO2为中间包覆层、聚环氧乙烷与聚环氧丙烷的嵌段共聚物为外壳层的核-壳-壳三层结构的磁性纳米复合粒子(PEOFSN)。该磁性纳米复合粒子不仅在室温，而且在蛋白质的生理潜伏期也可以稳定存在，即使在外加高强度磁场的条件下，仍然具有很高的长时间稳定的r2/r1比值，同时没有细胞毒性。可以作为磁共振成像的对比剂。

Kumagai等[26]合成了用高密度聚乙二醇表面包覆的以γ-Fe2O3为核、Au为壳的磁性纳米复合粒子(AuIONs)。在老鼠皮下胰腺癌模型注射该磁性纳米复合粒子后，其磁共振T2加权图像的信号显著加强，可以作为诊断恶性肿瘤的T2加权磁共振成像对比剂。

5 肿瘤磁感应热疗

肿瘤磁感应热疗是近年来发展的一种加温治疗肿瘤新方法[27]。它利用铁磁性物质能在交变磁场中升温的物理特性，将磁性物质作为热介质引入肿瘤组织，磁介质在外加交变磁场作用下升温并将肿瘤组织加热到治疗温度，同时保护了肿瘤组织周围的正常组织。由于这种能量靶向定位的治疗方法可有效杀死肿瘤细胞，且无明显副作用[6]，是具有潜力的肿瘤治疗新技术。对于应用于磁感应热疗的微(纳)米磁性材料，由于颗粒尺寸的不同导致了其产热机制与应用都不尽相同，其中主要的产热机制是磁滞效应[28]。热疗过程中超顺磁性材料所需外加磁场的强度比铁磁体的小得多，更有利于提高肿瘤热疗的效果。

陈本科等[29]采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子，经表面氨基化修饰后在其表面耦联鱼精蛋白。所制备的磁性纳米粒子粒径约10 nm左右，在交变磁场下具有良好的升温性能。鱼精蛋白功能化修饰磁性纳米粒子后，其Zeta电位进一步增大，更利于与DNA有效结合，对于HepG2细胞系，其转染绿色荧光蛋白质(pEGFP-N1)质粒的效率高于真核转染试剂(Vigofect)。研究表明，鱼精蛋白功能化修饰的铁氧磁性纳米粒子可作为磁转染的有效载体，由于其同时具备在交变磁场下升温的性能，在基因治疗联合热疗的研究领域具有一定的应用价值。

赵印敏等[30]采用化学共沉淀法制备葡聚糖包覆的超顺磁性纳米粒子，并将其共价耦联靶向血管新生肽RGD10，合成了一种具有靶向新生血管特点的葡聚糖包覆超顺磁性纳米复合粒子。该磁性纳米复合粒子近似圆形，直径为30～40 nm，核心铁颗粒直径为8～10 nm，铁含量为(1.71±0.16) g·L-1；其利用RGD肽与整合素的亲和力结合在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表面，结合率为(54.4±8.2)%，用交变电场处理后，显示有(38.4±9.8)% HUVECs发生凋亡。小鼠肿瘤冰冻组织切片观察发现，磁性纳米复合粒子与肿瘤组织有较好的亲和力。局部热疗后荷瘤小鼠的抑瘤率为54.8%，与对照比较，差异有统计学意义(P<0.05)。该磁性纳米复合粒子在大小和性能上符合热疗要求，与HUVECs有较好的亲和力，具有肿瘤组织靶向结合能力，局部热疗后对肿瘤生长具有一定的抑制作用。

Martín-Saavedra等[31]制备了一种磁性核壳介孔氧化硅纳米微球(MMS)。该磁性纳米微球有着很好的生物相容性，其细胞的形态和新陈代谢活动不受影响；在低频交变磁场作用下，可以产生磁热，最高温度为42 ℃；且具有良好的磁热强度的可控性以及对于特定细胞的摄取性，是一种理想的磁热疗试剂。

Hayashi等[32]制备了经叶酸(FA)和β-环糊精(CD)表面修饰的功能化超顺磁性纳米粒子(FA-CD-SPIONs)，其中CD对于药物具有良好的包容性、FA作为乳腺癌肿瘤靶向配体并赋予FA-CD-SPIONs癌症靶向药物功能。分析结果显示，FA-CD-SPIONs粒径为12.4 nm，能够在水中稳定存在。在16 000 Oe时，饱和磁化强度为51 emu·g-1。在特定的低频交变磁场(230 kHz、100 Oe)作用下，FA-CD-SPIONs有着特定的吸收率(132 W·g-1)，通过改变磁场，FA-CD-SPIONs可以感应磁热从CD中释放药物。同时，FA-CD-SPIONs对细胞无毒副作用，可以用于药物输送和磁热疗。

Lartigue等[33]首先通过热分解合成粒径4～35 nm的氧化铁磁性纳米粒子，然后通过配体交换反应，得到了一种在水中具有良好分散性且可以长时间稳定存在的糖类包覆的磁性纳米复合粒子。其中粒径为16～18 nm的粒子，具有良好的横向弛豫系数(是目前最好的可用商业产品的3倍)和很宽的磁热释放频率范围。该磁性纳米复合粒子具有用于磁流体热疗和用于阴性磁共振成像造影剂的潜在价值。

6 结语

随着纳米技术的迅速发展，磁性纳米粒子的合成技术已趋于成熟，研究者们可制备不同形状、不同大小、不同组分的磁性纳米粒子，再在其表面通过分子吸附或氢键作用进行修饰或连接上不同的生物分子、有机分子、金属或无机化合物等，将磁性纳米粒子应用于生物学及医学等领域也越来越受到重视。磁性纳米粒子的生物学及医学应用，除了与纳米粒子自身的化学组成、颗粒尺寸密切相关外，还在很大程度上取决于纳米粒子表面的物理化学性质，表面性质的差异使得纳米粒子在生物体内表现出完全不同的行为，包括血液循环行为的差别及体内分布与代谢途径的差别等。总之，现阶段以生物体内应用为目标的磁性纳米粒子研究，仍有下列值得深入研究的重要问题：(1)构建并制备尺寸小、粒径均一、分散性和环境相容性好、表面活性基团丰富的多功能磁性纳米粒子；(2)根据被检测分子的特点设计多功能磁性纳米粒子，实现高灵敏度、特异性检测；(3)利用磁性纳米粒子作为分子探针进行实时、在线、原位、活体分子的检测；(4)解决磁性纳米粒子的各向异性，进一步发展其免疫逃逸措施，有效避免免疫系统对磁性纳米粒子的吞噬，进一步提高磁性纳米粒子到达并有效富集于病灶部位的几率；(5)深入研究磁性纳米粒子在人体内的代谢和清理机制及其使用剂量和毒性，系统研究磁性纳米粒子表面与肿瘤细胞和正常组织的生物学作用机制，以提高其抗癌能力，同时降低对人体的副作用；(6)提高靶向载体的药物负载能力和在靶向部位释放药物速度的可控性，提高磁介质的靶向性，提高磁性纳米粒子的产热效率；(7)研究磁性纳米粒子体内分布与其表面修饰结构、物理化学性质的相关性，考察磁性纳米粒子尺寸对其体内分布、代谢途径、血液循环行为的影响等。

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