正交试验优选独一味总黄酮的提取工艺

王 超，王 永，宋 剑，李云鹏，秦 拢，王 猛，安军永

（石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035）

独一味系藏族习用药材，为唇形科植物独一味的干燥地上部分，性甘、苦、平，归肝经，具有活血止血、祛风止痛等功效，用于跌打损伤、外伤出血、风湿痹痛、黄水病等症。独一味主要分布在甘肃甘南、四川若尔盖、西藏林芝等藏区[1]，藏语称为“大巴”“打布巴”，最早载于《四部医典》《月王医诊》等藏医名著[2]。其主要化学成分为黄酮类、苷类、挥发油类和其他类成分[3]，其中黄酮为其主要成分。笔者采用乙醇为提取溶剂，用 L9（3）4正交设计，以总黄酮含量、山栀苷、甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量以及出膏率为指标，优选独一味药材的提取条件，为其总黄酮的分离纯化工艺提供试验依据，现报道如下。

1 仪器与材料

98－1－B型电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；S－FCJ－03型电热鼓风干燥箱（江苏海门县试验仪器厂）；FW 177型中草药粉碎机（天津市索斯特仪器有限公司）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；SHZ－D型循环水真空泵（河南郑州长城科工贸有限公司）；HH.S11－2型电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；UV－2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；Agilent1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorius BS 110型电子天平。独一味药材购自河北安国以岭饮片有限公司（产地为甘肃，批号为100301），经本公司田清存高级工程师鉴定，与2010年版《中国药典（一部）》正品相符；山栀苷甲酯对照品（批号为111873－201001），8－O－乙酰山栀苷甲酯对照品（批号为111872－201001），芦丁（批号为100080－200707）均购自中国食品药品检定研究院；95％乙醇（药用规格）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 总黄酮含量测定（紫外分光光度法）

2.1.1 溶液制备

取芦丁对照品10 mg，用P2O5真空干燥器干燥24h，精密称定，置50mL容量瓶中，加70％乙醇至刻度摇匀，即得质量浓度为0.2 g/L的对照品溶液。精密量取提取液2.5mL，加入5％亚硝酸钠10mL，摇匀，放置6min；加入10％硝酸铝10mL，摇匀，放置6min；加入4％氢氧化钠100mL，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.2 方法学考察

标准曲线制备：精密吸取一定量对照品溶液1，2，3，4，5，6mL，分别置25mL量瓶中，各加蒸馏水至6mL，按供试品溶液制备方法处理，放置15min，在500 nm波长处测光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘标准曲线，得回归方程 Y=16.643X+0.074。r=0.993 7（n=6）。结果表明，芦丁质量浓度在8～48μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

稳定性考察：选取某一质量浓度的供试品溶液，按上述条件测定吸光度，间隔2h测定1次。结果 RSD=0.88％，表明供试品溶液24h内稳定。

重复性试验：取同一批样品，依法制备供试品溶液并连续测定5次。结果的 RSD=1.08％，表明方法重复性良好。

回收率试验：取已知含量的独一味总黄酮提取物，精密称定，加入小檗碱对照品适量，制备供试品溶液，测定吸光度。计算得平均加样回收率为98.7％，RSD为2.25％（n=9）。

2.2 山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量测定[4]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：VP－ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：30℃；检测波长：235 nm；流速：1.0mL/min；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱（见表1）。

2.2.2 对照品溶液制备

表1 流动相梯度洗脱表

取山栀苷甲酯对照品、8－O－乙酰山栀苷甲酯对照品各15mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，作为贮备液，吸取10mL，置50mL量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为30μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

标准曲线制备：精密吸取一定量对照品贮备液，用甲醇配制成质量浓度为5，20，30，40，60μg/mL的混合对照品溶液，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪中，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程山栀苷甲酯 Y=4 179.9 X－112.59（r=0.999 3），8－O－乙酰山栀苷甲酯 Y=1 673.7 X－11.547（r=0.999 5）。结果表明，山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯对照品质量浓度在5～60μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：选取某一质量浓度的供试品溶液，按拟订条件测定含量，间隔2h测定1次。结果供试品溶液在24h内稳定，山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯的 RSD分别为0.52％和0.81％。

重复性试验：取同一供试品溶液连续测定5次。结果山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯的 RSD分别为0.32％和0.55％，表明方法重复性良好。

回收率试验：取已知含量的独一味药材提取液，精密称定，加入山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯混合对照品适量，制备供试品溶液，测定含量。计算平均加样回收率分别为98.7％和98.2％，RSD分别为1.25％和1.31％（n=6）。

2.3 提取工艺研究

2.3.1 提取溶剂考察

称取4份独一味药材，每份30 g，分别加入10倍量的不同体积分数的乙醇为提取溶剂，提取2次、每次2h，提取液定容于1 000mL量瓶中，精密量取提取液25mL到100mL量瓶中，以总黄酮含量、山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量以及出膏率为指标考察，结果见表2。可见，乙醇体积分数越高，指标性成分含量越高，但是出膏率随着醇浓度的提高而降低，而用70％乙醇和80％乙醇作为溶剂提取对含量影响较小，且70％乙醇提取的出膏率较高。综合考虑，选择70％乙醇作为药材的提取溶剂。

表2 提取溶剂考察结果

2.3.2 正交试验方法

选取对药材提取影响较大的提取次数（因素A）、提取时间（因素B）、加醇量（因素C）进行考察，将药材粉碎成粗粉，按 L9（34）表进行试验，每份样品的称样量为30 g，提取液定容于1 000mL量瓶中，精密量取提取液25mL到100mL量瓶中，分别以总黄酮、山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯为含量指标，以出膏率为指标考察。因素水平表见表3，各指标成分的正交试验结果及方差分析结果见表4至表9。可见，对本试验结果影响较大的因素为，提取次数＞提取时间＞加醇量，选择的因素中只有提取次数对3个考察指标有显著性影响，其他因素影响较小，因此确定本药材的最佳提取工艺为A3B3C3。由直观分析表可知，提取2h和1.5h以及加10倍量和12倍量溶剂对本试验的影响较小，因此选择优选工艺为A3B2C2。

表3 因素水平表

表4 山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量直观分析表

表5 山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量方差分析表

表6 总黄酮直观分析表

表7 总黄酮方差分析表

表8 出膏率直观分析表

表9 出膏率方差分析表

2.3.3 验证试验

称取两组独一味药材，每组3份，每份30 g，一组按照最佳工艺A3B3C3进行提取，一组按照优选工艺提取，提取液分别定容于1 000 mL容量瓶中，精密量取提取液25 mL到100 mL容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度，以总黄酮含量、山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量以及出膏率为指标考察，结果见表10。可知，最佳工艺结果为：平均山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量每30 g药材含191.1mg，平均总黄酮含量为每30 g药材含1 804.6 mg，平均出膏率为28.1％。优选工艺结果为：平均山栀苷甲酯+8－O－乙酰山栀苷甲酯含量为每30 g药材含187.1 mg，平均总黄酮含量每30 g药材1 789.7mg，平均出膏率为27.3％。通过两个不同工艺的相关指标对比发现，试验结果相差不大，但考虑到优选工艺省时省工，可降低生产成本，故选择优选工艺A3B2C2（即加10倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h）为独一味药材的提取工艺。

表10 验证试验结果

2.4 3批中试试验

称取独一味药材3份，每份3 000 g，分别按照确定的提取工艺进行提取，样品定容稀释到合适的质量浓度，以总黄酮含量、山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯含量和出膏率为指标考察。结果见表11。可知独一味药材提取工艺稳定可行。因此，确定提取工艺为加70％乙醇10倍量，提取3次，每次1.5h。

表11 3批中试考察结果

3 讨论

通过正交试验，确定独一味药材总黄酮提取的优选工艺为A3B2C2，即加10倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h和最佳工艺为A3B3C3，即加12倍量70％乙醇，提取3次，每次2h。通过验证试验进行对比发现，试验结果相差不大，综合考虑确定独一味药材的提取工艺为A3B2C2，通过3批放大中试试验，结果表明本提取工艺稳定可行。

独一味的有效成分和指标性成分为山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯。在考察总黄酮提取工艺时，考虑到采用山栀苷甲酯和8－O－乙酰山栀苷甲酯作为指标性成分考察的试验结果不够全面，因此采用总黄酮含量和出膏率为指标进行提取工艺研究。用以上3个指标作为独一味药材总黄酮提取工艺条件，较全面地筛选出了独一味总黄酮的提取工艺，可为独一味药材资源的有效使用提供参考。

[1]罗达尚.中华藏本草[M].北京：民族出版社，1997：274.

[2]孟保华，孟宪丽.藏药独一味药理作用研究进展[J].中国药房，2009，20（3）：232.

[3]梁重栋.藏药独一味的基础与临床研究[J].兰州医学院学报，1987，40（2）：47.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：285－286.