CARP在心血管系统的作用

黄晓娇，陈漠水

（中南大学湘雅海口医院 海口市人民医院心内科，海南 海口 570208）

心脏是胚胎发育过程中形成最早的器官。胚胎发育时期心肌细胞增殖分化过程中的基因表达异常是常见的引起心脏出生缺陷的原因[1]。在病理情况下，胚胎期心脏高表达的一些基因会在成年期心脏中再度表达，进而导致心肌肥大、心脏机能下降等一系列心脏疾病。在分子水平上研究心肌发育过程中的重要因子，有助于分析复杂的心肌发育过程，也有助于进一步了解心血管疾病的发病机制。从分子水平考虑，心肌的分化过程始于某个或某些关键基因的启动，它们可以使下游的靶基因呈级联式的激活，直至分化完成。通常这些基因的蛋白产物都是转录因子或与转录因子相互作用的蛋白，是组织器官发育的重要节点分子。心锚重复蛋白(Cardiac ankyrin repeat protein，CARP)就是这样一个与心血管系统发育和重塑密切相关的关键节点分子。研究CARP对多种心脏病的早期诊断和治疗具有重要的理论和实践意义。

1 CARP命名

1995年Chu等[2]通过差异筛选白介素1和肿瘤坏死因子刺激的人真皮微血管内皮细胞，分离出一种转录因子，命名为C-193，编码CARP的全长cDNA，这种转录因子可被诱导。转录因子是一类能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，在胞质的核糖体上合成，接受来自细胞膜并逐渐传递进来的信号之后，通过磷酸化或脱磷酸化等作用而被活化，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件，启动和调控基因表达[3]。1997年，三个独立的实验室分别得到了大鼠的CARP[4-6]，并分别命名为心脏阿霉素反应性蛋白(Cardiac adriamycin responsive protein，CARP)、心肌锚定重复序列蛋白(Cardiac ankyrin repeat protein，CARP)和 ANKRDl(Ankyrin repeat domain 1)蛋白。心锚重复蛋白现无明确的定义，其分子机制尚不清楚。

2 CARP基因和蛋白质结构

人的CARP基因定位于10号染色体，其cDNA全长1 901个碱基对，编码的多肽含有319个氨基酸，相对分子质量为36 kDa。CARP基因共含有9个外显子，CARP的mRNA 3'-UTR包含一个串联的ATTTA的重复序列，与降低mRNA的稳定性有关。在CARP基因的近端启动子，含有在骨骼肌和心肌细胞中调节转录的E-box、CCAC-box及GATA-4结合位点，GATA-4受Nkx2.5的间接调控而共同调节CARP转录。另外，还有作为转录增强子1的结合位点的几个M-CAT box，需要它来激活心肌和骨骼肌特异的基因。启动子缺失实验证实，从+47-166的213 bp序列能够充分保证CARP的心肌特异性表达[7]。CARP包括1个二连核定位信号区(71～80，94～103)、1个PEST样序列[即富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸序列(108～126)]、4个锚定重复序列(152～283)和多个相同的蛋白质磷酸化位点。CARP和一些已知的转录因子如NF-KB等在结构上有相似之处，都有锚定重复序列和细胞核定位信号区域。CARP含有4个锚定重复序列，这种序列在400多种蛋白中都有，包括细胞周期素依赖性激酶抑制因子、转录调节因子、细胞骨架组织因子、发育调节因子和毒素[8]。此重复序列在IκB家族中已经有较好的研究，在IκB中ANK重复序列与核因子κB(NF-κB)结合，在功能上抑制转录因子活性。与之相类似，在心肌中CARP与转录因子YB-1结合，在平滑肌和上皮细胞中CARP也可能是转录因子的负调节因子。锚定重复序列在CARP的功能中起到关键作用，它通过与其他蛋白相互作用行使具体功能。

3 CARP的表达

CARP富含于成熟心脏，在心脏中组成性、特异性地高表达，在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌、胎盘、蒲肯野氏细胞、肺上皮细胞、肝肿瘤细胞和乳腺癌细胞中也有少量表达[9-10]。

CARP表达的主要影响因素有：各种可诱导氧化应激的因素(如阿霉素、缺氧、缺血再灌注等)、心脏容量和(或)压力超负荷因素（扩张性心肌病或心肌肥厚）、β肾上腺素受体的激动因素、蛋白激酶A及钙调节蛋白依赖性激酶的激活因素[10]、心肌或组织的损伤以及肿瘤坏死因子α、白介素-l、转化生长因子-β、血管紧张素-II、单核细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1等[11-13]。并有一些研究对这些调节作用的分子机制进行了初步探讨[14]：α1肾上腺素能受体通路促进CARP基因在心肌细胞中的表达，转录因子GATA-4在这种调节过程中发挥作用。

4 生物学功能

CARP属于肌肉锚定重复蛋白家族，锚定蛋白是一类整合了信号传导通路中多种信号分子的蛋白[15]，CARP含有4个ANK重复序列（即锚定重复序列，是33个氨基酸重复出现形成的一种蛋白质序列模块），可以介导多种蛋白质间的相互作用，并且能与多种配体结合。这种结构特征赋予了CARP蛋白多种生物学功能。

4.1 调节心脏生长发育 CARP是心脏细胞系的早期标志物之一。它在胚胎期、新生期和成年心脏中都有高水平的表达。CARP在生心板和心脏管中与Nkx2.5/Csx、肌细胞增强子 2(Mef2C)、GATA-4 和dHAND等转录因子同期出现[5]，相互影响，受调节的CARP进一步调节与心脏发育有关的下游基因，如心室肌基因的表达、YB-1的活性等[16]。

4.2 维持心肌结构和功能完整 CARP不仅作为转录因子进入细胞核，调节心脏中肌球蛋白轻链2、肌动蛋白、心肌肌钙蛋白C和心钠素等的启动子激活[15]，CARP本身还是titin牵张传感复合体的元件，参与牵张应激通路[16]，而且，在细胞质中CARP与myopalladin的羰基端和肌联蛋白N2A表位同时存在于横纹肌肌节的中央I带，与钙蛋白酶3一起组成肌联蛋白N2A-信号复合体，参与维持肌节结构和功能的完整[2]，myopalladin的羰基端与CARP蛋白特异性结合，Myopalladin-CARP复合体的过表达会使肌节结构和功能受到破坏[17]。可见CARP自身作为一种心肌结构蛋白发挥作用的同时，也严重影响着其他心肌结构蛋白、收缩蛋白的表达和功能性组合，这些分子水平的改变会导致心房肌细胞间连接的改变，比如通过与钙调节蛋白联系调节心脏肌肉细胞兴奋收缩耦联，从而影响心肌细胞间信号的传导。

4.3 诱导血管新生和组织修复 在大鼠模型中发现，损伤的皮肤、骨骼肌、血管壁、毛囊、炎性细胞和真皮中CARP表达明显增高，并且Ad-CARP处理可增加损伤区的血流量[18]。可能是由于CARP的转录特性抑制了血管源性抑制因子，或激活了经典血管源性调节因子,如血管紧张素-Ⅰ和早期生长反应因子1，从而诱导血管新生[19-20]。

4.4 调节细胞凋亡 异丙基肾上腺素上调CARP的表达，而依赖钙调蛋白的蛋白激酶-Ⅱ(CaMK-Ⅱ)调节β1受体激活引起的心肌细胞凋亡，说明CARP在心肌细胞凋亡中起一定作用[21]，CARP的促凋亡作用与负向调节细胞周期有关。CARP可负向调节血管平滑肌细胞周期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

5 CARP与心血管疾病

5.1 心肌肥厚 CARP在心血管疾病的研究最早开始于其编码基因在心肌肥厚模型中的表达，发现CARP腹主动脉缩窄型、自发性高血压型、异丙肾上腺素诱发的心肌肥厚、狗妊娠期心肌肥厚等[22-24]多种心肌肥厚模型中升高，目前CARP已被视为心脏肥厚的标志物[24]。在心脏肥厚期间CARP mRNA快速性、特异性、持久性的提高，并与c-fos、C-jun、c-myc、egr-1等其他可被肥厚诱导的细胞核因子形成鲜明对比，后者只在心脏超负荷时表达量瞬间一过性增加[23]。P38和Racl的过表达可激发CARP启动子的转录，它们是应激和丝裂原激活的蛋白激酶途径的组分，而应激和丝裂原激活的蛋白激酶途径与心脏肥厚相关，提示CARP蛋白可作为心脏肥大的标志物[23]。由于CARP起转录辅阻遏物的作用，CARP的过表达抑制蛋白质合成和细胞增大，推测CARP对心肌肥大产生抑制性影响[25]，可能在压力和容量过负荷后心肌肥大过程中，CARP被诱导，可能是一种抗肥大的适应机制。

5.2 心力衰竭 CARP的过表达与各种心肌损伤和心脏组织收缩功能恶化相关。在盐敏感大鼠心脏肥厚模型中，CARP与BNP的表达在mRNA水平上强烈相关，呈明显上调表达，提示这两个蛋白的基因被相同的机制所调节[26]。在小鼠扩张性心肌病和肥厚模型、猪静脉注射阿霉素诱导心衰模型、起搏诱导犬心衰模型(无肥大)的心肌中均增高[27]。姜升阳等[28]通过代表性差异分析(RDA)发现犬的CARP在心衰的心肌中表达上调。CARP在人心力衰竭心脏中表达亦增加[26]，扩张性或缺血性心肌病所致心力衰竭患者中，CARP在左心室心肌层中表达可增加1.8倍。刘文玲等[14]通过实验证明GATA-4通过调控心房利钠肽、脑利钠肽、B细胞淋巴瘤因子2、心肌锚定重复序列蛋白等多种心肌重塑相关转录因子的表达参与心肌重塑过程。

5.3 粥样硬化斑块 De Waard等[16]分别在大、小鼠两种平滑肌动脉粥样硬化模型中，用原位杂交的方法检测了CARP基因在转录水平上的表达，发现粥样硬化斑块损伤的主动脉或回肠动脉的内皮细胞和平滑肌细胞中CARP呈阳性表达，提示了CARP在动脉粥样硬化过程中的作用。CARP负向调节细胞周期，抑制蛋白质合成，在动脉粥样硬化病变中抑制血管平滑肌增殖，抑制粥样斑块形成；CARP在粥样硬化斑块的内皮细胞中表达，而在巨噬细胞中无表达[16]。CARPmRNA在内膜平滑肌细胞亚群中表达，而在休眠的平滑肌中无表达，说明CARP的表达与内膜静止的平滑肌群有关，可能参与其从活化型向静止型的转变过程[16，29]。

5.4 心律失常 CARP自身作为一种心肌结构蛋白发挥作用，也严重影响着其他心肌结构蛋白、收缩蛋白的表达和功能性组合，这些分子水平的改变会导致心房肌细胞间连接的改变，比如通过与钙调节蛋白联系调节心脏肌肉细胞兴奋收缩耦联[21]，从而影响心肌细胞间信号的传导，使复极过程在空间上变得不一致，明显增加不应期离散，增加早搏刺激产生波裂和诱发折返的能力，导致心房内多条折返径路存在。Yasushi等[21]构建编码人CARP腺病毒和对照病毒。用携带CARP基因的重组腺病毒感染的基因工程心脏组织和对照心脏组织相比，尽管基本收缩力无区别，但前者在对钙离子和异丙肾上腺的收缩应答中显著减弱。CARP可能通过与钙调节蛋白联系调节心脏肌肉细胞兴奋收缩耦联，从而影响心肌细胞间信号的传导。台湾学者Chen等[30]发现在心房颤动病人中FHL1、TSC-22和CARP明显正调节，体外实验发现异丙肾上腺素使CARP的表达显著提高，分析CARP与β肾上腺素受体信号通路、RAS信号通路均密切相关。而自主神经对心肌细胞的自律性和传导性都起着重要的作用[31]。

6 展 望

CARP在心脏特异性表达，并参与心脏的形成和发育，维持心肌正常的结构和功能，诱导血管新生等多种功能。在许多形式的心脏肥大和心力衰竭的心室中，因其表达明显增高而被视为心脏肥厚的标志物。CARP的过表达可能与各种心肌损伤和心脏组织收缩功能恶化相关。对其进行更深入的研究不仅有助于阐明肌肉发育的分子机制，而且可为药物干预防治心血管疾病提供一个新的视野。

[1]Srivastava D.Making or breaking the heart：from lineage Determination to morphogenesis[J].Cell,2006,126(6)：1037-1048.

[2]Chu W,Burns BD,Swerlicks RA,et al.Identification and characterization of a novel cytokine-inducible of a novel cytokine-inducible nuclear protein form human endothelial cells[J].BiolChem,1995,270(18)：10236-10245.

[3]章有章,查锡良,李 刚,等.生物化学与分子生物学[J].科学技术出版社,2005,37(10)：26.

[4]Jeyaseelan R,Poizat C,Baker RK,et al.A novel cardiac restricted target for doxorubicin.CARP,a nuclear modulator of gene expression in cardiac progenitor cells and cardiomyocytes[J].J Biol Chem,1997,272(36)：22800-22808.

[5]Zou Y,Evans S,Chen J,et al.CARP,a cardiac ankyrin repeat protein,is downstream in the Nkx2.5 homeobox gene pathway[J].Development,1997,124(4)：793-804.

[6]BaumeisterA,Arber S,Caroni P.Accumulation of muscle ankyrinrepeat protein transcriptreveals local activation of primary myotube endcompartments during muscle morphogenesis[J].J Cell Biol,1997,139(5)：1231-1242.

[7]Kuo H,Chen J,Ruiz-Lozano P,et al.Control of segmental expression of the cardiac-restricted ankyrin repeat protein gene by distinc tregulatory pathways inmurine cardiogenesis[J].Development,1999,126(19)：4223-4234.

[8]Sedgwick SG,Smerdon SJ.The ankyrin repeat：a diversity of interactions on a common structural framework[J].Trends Biochem Sci,1999,24(8)：311-316.

[9]Park JH,Liu L,Kim H,et al.Identification of the genes involved in enhanced fen retinide-induced apoptos is by parthenolide in human hepatoma cells[J].Cancer Res,2005,65(7)：2804-2815.

[10]Laganiere J,DebloisG,Lefebvre C,et al.Location analysis of estrogen receptor alpha target promoters reveals that FOXA 1 defines a domain of the estrogen response[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(33)：11651-11656.

[11]Susan ES,Yubin S,Jeffrey M,et a1.Novel actions of cardiac ankylin repeat protein[J].International Congress Series,2007,1302：53-64.

[12]Oliver Z,Marcus F,Alexander M,et a1.Cardiac ankyrin repeat protein,a negative regulator of cardiac gene expression,is augmented in human heart failure[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,293：1377-1382.

[13]Han HC,Austin KJ,Nathanielsz PW,et a1.Maternal nutrient restriction alters gene expression in the ovine fetal heart[J].J Physiol,2004,558：111-120.

[14]刘文玲,胡大一.ANK2基因突变导致的遗传性心律失常[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2006(1)：13-15.

[15]Zolk O,Marx M,Jackel E,et al.Beta-adrenergic stimulation induces cardiac ankyrin repeat protein expressiont involvement of protein kinase A and calmodulin-dependent kinase[J].Cardiovasc Res,2003,59(3)：563-572.

[16]De Waard V,van Achterberg TA,Beauchamp NJ,et al.Cardiac ankyrin repeat protein(CARP)expression in human and murine atherosclerotic lesions activin induces carp in smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(1)：64-68.

[17]Gotthardt M,Hammer RE,Hübner N,et al.Conditional expression of mutantMline titins results in cardiomyopathy with altered sarcomere structure[J].Biol Chem,2003,278(8)：6059-6065.

[18]Alan RC,Janet S,Wang W,et a1.Osteopontin modulates angiotensin II induced fibrosis in the intact murine heart[J].J Am Coil Cardiol,2004,43：1698-1705.

[19]BoenglerK,Pipp F,Fernandez B,et al.Arteriogenesis is associated with an induction of the cardiac ankyrin repeatprotein(carp)[J].Cardio Vasc Res,2003,59(3)：573-581.

[20]ShiY,Reitmaier B,Regenbogen J,et al.CARP,a cardiac ankyrin repeat protein,is up-regulated during wound healing and induces angiogenesis in experimental granulation tissue[J].Am J Pathol,2005,166(1)：303-312.

[21]Yasushi Aihara,Masahiko Kurabayashi,Yuichiro Saito,et a1.Cardiac Ankyrin Repeat Protein is a Novel Marker of Canine Hypertrophy Role of M-CAT Element Within the Promoter[J].Hypertension,2000,36：48-53.

[22]IharaY,SuzukiYJ,K ittaK,et al.Modulation of gene expression in transgenic mouse hearts overexpressing calsequestrin[J].Cell Calcium,2002,32(1)：21-29.

[23]Aihara Y,Kurabayashi M,Saito Y,et al.Cardiac ankyrin repeat pro tein is a novel marker of cardiac hypertrophy：role of M-CAT element within the promoter[J].Hypertension,2000,36(1)：48-53.

[24]史 强,魏英杰,胡盛寿.CARP蛋白与心脏病[J].医学研究杂志,2008,37(10)：18-21.

[25]李向东,彭 艳,肖 骅,等.P38和CARP的表达与大鼠心肌梗死后心肌重塑的关系[J].山东医药,2009,49(29)：4-6.

[26]Baumeister A,Arbor S,Caroni P.Accumulation of muscle ankyrin repeat protein transcript reveals local activation of primary myotube endcompartments during muscle morphogenesis[J].J Cell Biol,1997,139：123l-1242.

[27]Zolk O,Frohme M,Maurer A,et al.Cardiac ankyrin repeat protein,anegative regulator of cardiac gene expression,is augmented in human heart failure[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,293(5)：1377-1382.

[28]姜升阳,徐 明,张幼怡.GATA结合蛋白4在心脏发育及心肌重塑中的作用[J].生理科学进展,2008,39(4)：302-306.

[29]Han HC,Austin KJ,Nathanielsz PW,et al.Maternal nutrient restriction alters gene expression in the ovine fetalheart[J].J Physio,2004,558(pt 1)：111-120.

[30]Chen CL,Lin JL,Lai LP,et al.Altered expression of FHL1,CARP,TSC-22 and P311 provide insights into complex transcriptional regulation in pacing-induced atrial fibrillation[J].Biochim BiophysActa,2007,1872(3)：318-329.

[31]毛焕元,曹林生,梁国芬,等.心脏病学[M].北京：人民卫生出版社,2001：77-79.