肠道菌群与儿童免疫

曹海宁 周昌宁

随着近年来各种分子技术在肠道微生物群落研究中的发展，人体肠道中定植的微生物群落的结构与功能正逐步得到了解。复杂的肠道微生物群落包含有500～1000种，达1013～1014个，10倍于人自身细胞总数[1]。由于儿童肠道生理功能特殊：婴幼儿时期肠道免疫功能不完善，且肠道菌群正处于生理性演替过程中，处于不稳定时期，年龄越小，微生态平衡稳定性越不稳定，易受到各种因素(如分娩方式、喂养方式、卫生环境、疾病和抗生素的应用等)的制约，从而导致严重的肠道微生态平衡紊乱，主要表现在以双歧杆菌为主的益生菌数量明显不足，菌群之间正常比例严重失衡；此外，正常肠道菌的转移和一些机会菌的大量生长繁殖。当肠道菌群的数量和种类发生异常变化，偏离正常的生理组合，转变为病理性组合状态，即出现菌群失调，导致许多相关疾病。本文将对其研究进展作一综述。

1 人体肠道菌群分布

细菌在人体胃肠道各部位定植的数量和种类各异[2]：胃内PH值偏酸性，含多种消化酶类，妨碍细菌增殖，因此，胃内细菌数量和种类均较少，总菌数103CFU／mL，除了幽门螺杆菌及相关的菌种外，还包括一些G+需氧菌，如奈瑟菌、葡萄球菌、链球菌、念珠菌和乳酸菌等。在小肠这个过渡区，虽然pH值有所升高，但含有的多种消化酶类更多，且蠕动功能强烈，分泌肠液多，能将细菌在繁殖前冲洗到回肠和结肠远端。因此，其细菌数量在胃和结肠之间逐渐增多，且十二指肠和空肠相对无菌。含菌浓度为0～105CFU／mL，以G+需氧菌为主，如葡萄球菌、链球菌和乳酸杆菌。在回肠中，G—菌开始超过G+菌，含菌浓度约103～107CFU／mL，但仍以需氧菌为主，包括拟杆菌和双歧杆菌等；盲肠与结肠中的细菌浓度较高，达1011～1012CFU／mL，且厌氧菌超过需氧菌102～104倍，超过98%，细菌种类也达300多种，干大便的重量近1／3是由细菌组成。以拟杆菌、真杆菌和双歧杆菌以及厌氧的G+球菌为主。

除此之外，同一肠道内不同类菌的空间分布也不一样[3]。总的来说，肠腔内肠道菌群形成3个生物层：里层为与粘膜上皮细胞粘连形成细菌生物膜的菌群称为膜菌群，包括双歧杆菌和乳酸杆菌，它们是肠道共生菌，是维持肠道正常生理功能两种主要细菌，对机体至关重要；中间主要为厌氧菌，包括粪杆菌、消化链球菌和优杆菌等；外层的细菌称为腔菌群，可游动，以大肠杆菌、肠球菌等需氧及兼性需氧菌为主。

2 儿童肠道菌群发育

新生儿出生后不久肠道内就有大量细菌定植，但其微生物稳态的建立是逐渐完成的动态过程，婴儿刚出生前在子宫内是处于相对无菌的环境，其肠道内是无菌的，出生后细菌迅速从口及肛门侵入，2h左右，肠道内很快植入肠球菌、链球菌和葡萄球菌等需氧菌。Yoshiok等[4]通过对新生儿出生后肠道菌群定植过程的研究，发现生后第1d肠内定植的优势菌是肠杆菌，其次是肠球菌、葡萄球菌和类杆菌，出生后第6d双歧杆菌数量逐渐增多成为优势菌，其优势状态可持续1～3个月。研究者们对哺乳期肠道菌群发育的研究有所分歧：Roberts[5]等对哺乳期小儿肠菌群的研究发现，出生后1w左右肠道内主要含有大量的双歧杆菌、肠球菌和肠杆菌，1个月后，双歧杆菌为优势菌，并伴有其他细菌的生长。Klesseu等[6]对生后第7d婴儿粪便菌群的研究，发现89%的婴儿检测到双歧杆菌，这种优势可持续3个月左右，此外，还发现大量肠杆菌、肠球菌、类杆菌和乳杆菌等。总之，出生后1w左右小儿肠道中含有大量的肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌，但随着时间迁移其数量逐渐减少，而双歧杆菌数量的逐渐升高，此后，乳杆菌数量随时间的推移逐渐增多。母乳喂养儿添加辅食时肠菌群结构将有所改变，主要表现在肠球菌和类杆菌数量逐渐增多，这种变化可能与粪便pH值密切相关；人工喂养儿添加辅食时这一变化主要是由于他们肠道内已存在大量的需氧菌和类杆菌，断奶后小儿的肠菌群结构越来越接近成人。Sepp等[7]对爱沙尼亚和瑞典两国儿童断奶后菌群结构进行了对比研究，发现所有婴儿粪便中均含有大量的肠球菌、双歧杆菌和类杆菌，而肠杆菌数量不多。Guerin-Danan等[8]对10～18个月断乳儿童粪便菌群的进行研究，发现其构成主要含有大量的双歧杆菌、肠杆菌和肠球菌，此外，部分儿童粪便中还含有乳杆菌。这证实婴儿后期逐渐断乳后，双歧杆菌数量有所减少，而肠道pH值随之升高，类杆菌、真杆菌、梭菌、乳杆菌、链球菌等数量将有所增多。至此，肠道菌群结构趋于稳定，这种状态维持整个儿童期和青壮年期。

3 肠道菌群与免疫

3.1 调节免疫系统免疫功能

人体肠道内数量最多的有益菌是双歧杆菌, 它在维持肠道微生态平衡,刺激机体特异性和非特异性免疫功能方面发挥的作用至关重要，Yasui等[9]研究发现，短双歧杆菌作用靶细胞后释放的活性因子可直接影响B细胞的分裂。De Simone等[10]让志愿者口服冻干分叉双歧杆菌胶囊后,发现外周血B细胞亚群比例显著升高。这说明双歧杆菌可促进B淋巴细胞的转化。Von der Weid等[11]研究发现,乳酸杆菌虽可使CD4+T细胞增殖减少,但IL-10和TGF-β的分泌增加。在肠道双歧杆菌数量减少，大肠埃希氏菌优势生长时，肠壁固有层中CD3+、CD4+、CD8+细胞明显下降，免疫调节功能减弱。Hatcher等研究发现，双歧杆菌菌体破碎后的可溶性提取物可使巨噬细胞的溶菌酶活性显著降低,巨噬细胞吞噬聚丙烯酰胺颗粒和活的沙门菌的能力增强。将双歧杆菌及其表面结构成分作为生物应答调节剂可使各种细胞因子和抗体的产生增加，并能显著提高NK和巨噬细胞活性等和全身的防御功能，且能发挥自稳调节、抗感染和抗肿瘤作用。因此,双歧杆菌对非特异性免疫增强作用效果明显。

除此之外，其它正常菌群也能调节机体免疫功能：如鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸球菌等是TNF-α和 IL-6的强有力的诱导剂，可使体液免疫增强；干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞, 刺激人体产生免疫反应。Gill等[12]将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌给小鼠口服后, 可增强脾细胞对丝裂原(ConA)和刀豆素(LPS)的增殖反应和血清中抗体应答。口服嗜乳杆菌胶囊也能显著升高人体外周血B细胞亚群比例。乳杆菌还能影响细胞免疫，有效阻止许多微生物的入侵和粘附。此外，吸附于人体的嗜乳杆菌能吸附于分化的肠道细胞上,杀灭入侵菌，发挥抗菌活性[7]。

3.2 屏障作用

机体的先天性或非特异性免疫反应，亦即机体免疫系统识别和排除各种异物，主要依靠机体的屏障作用，包括正常菌群是屏障作用的第一道防线。从现代的研究不难看出[13]，在机体的屏障作用中极为重要。肠道微生物定植抗力(colonization resistance，CR)由荷兰微生物学家Van der waaij教授提出的[13]，是指肠道内源性专性厌氧菌具有抑制消化道中主要属需氧菌的潜在致病菌群数量的能力。Vollaard认为粪便中需氧G-杆菌、肠球菌、酵母菌的数量和双歧杆菌与肠杆菌的数量比值可作为肠道微生物定植抗力的指标[14]。

3.3 免疫佐剂活性

Himanen等[15]研究发现，枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖-磷壁酸复合物均具有很强的免疫佐剂活性。此外，机体经口服芽孢杆菌后，在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂，促进免疫应答，或者通过调整宿主体内的微生物群，尤其是双歧杆菌菌群，间接的发挥免疫佐剂的调节作用，使机体的局部或全身防御功能显著提高[10]。

3.4 协同拮抗病原菌入侵

肠道细菌通过激活穿越上皮细胞的运输通路和特异的DC，穿过粘膜屏障与固有层免疫细胞相互接触，持续激活粘膜免疫系统，一旦致病菌入侵即可引起病理反应[16]。Hooper等研究发现，宿主和肠道菌群的相互作用对粘膜结构和功能有重要作用。此外，还发现无细菌的动物粘膜浆细胞很少，因此认为IgA产生是直接依赖肠道菌群[17]。有文献报道菌群缺陷时，固有层淋巴细胞减少。当菌群重新建立时，固有层淋巴细胞恢复正常，说明控制炎症就要控制细菌，无细菌的动物存在免疫缺陷[18]。总之，肠道菌群是宿主免疫组成的一部分。

3.5 免疫系统对肠道菌群的作用

SIgA由两个IgA聚合而成，分子的直径较大，可抑制肠道内的细菌粘附肠道粘膜表面，还可中和肠道内的毒素、酶和病毒，并结合抗原形成免疫复合物由吞噬清除。SIgA直接作用于细菌表位，尤其对肠道菌群中的革兰阴性杆菌具有特殊的亲和力，能包被细菌，封闭细菌与肠上皮细胞结合的特异部位，阻止其与肠上皮细胞的吸附，避免细菌穿透肠上皮发生移位，是阻止细菌移位的重要环节[19]。Macpherson和Uhr实验中，通过肠系膜淋巴结中树突状细胞携带的活细菌数的检测，发现SIgA能够阻止细菌穿透肠上皮细胞层，并限制共生菌侵入肠系膜淋巴结。这种保护性作用依赖于一个低亲和力，高容量系统，增加细菌的流动直径，阻止细菌入侵[19]。另有试验表明，当生物菌膜和戊二醛固定的Caco-2细胞共同培养时，SIgA可提高菌膜的建立，菌膜的建立除了依赖菌毛的表达外，也表现为SIgA依赖性[20]。

4 肠道菌群与疾病

正常情况下肠道菌群与肠道免疫通过精密的调控机制和平共处，处于动态平衡状态，一旦这种机制被破坏，将会导致一系列疾病发生发展。若肠道免疫系统失去对正常菌群某些抗原的耐受能力，可在肠道局部可产生炎症反应，诱发炎症性肠炎(包括溃疡性结肠炎、克罗恩病)；此外，由于机体与细菌存在交叉抗原，可诱发全身炎症反应，导致某些自身免疫性疾病的发生。无菌动物不能用来建造炎症性肠炎及自身免疫性疾病的动物模型，这也支持这一观点。很多临床资料表明，利用肠道活得正常菌群如：乳酸杆菌、双岐杆菌、非致病性大肠杆菌，治疗炎症性肠炎、婴幼儿湿疹、食物过敏取得了很好疗效，而且无副作用，作用更持久。当肠道免疫功能下降时，肠道细菌由于失去监控，会出现过度繁殖、细菌移位。如在严重创伤后，可因肠道细菌移位及释放大量内毒素而引发或加重多脏器功能衰竭；在急性胰腺炎时，肠道细菌可通过毛细淋巴管，经胸导管、心脏，到达肺部，诱发胰腺炎相关性肺炎；HW感染的患者易出现肠道细菌过度繁殖引起的细菌性腹泻。这类疾病都可通过提高机体免疫力或用益生菌改善肠道菌群来预防和治疗。

5 结语

正常菌群对儿童肠道是有利的，它们除能促进肠道消化吸收外，还能抵御一些病原菌通过肠道侵入体内，抑制致病微生物的生长，是机体免疫统不可缺少的重要组成部分。研究了解正常菌与动物免疫的相互关系，研制有益菌构成的微生制剂在动物疫病防治上必将有着深远的意义。

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