CCN蛋白的功能与机制

鲍艳芳 应素芬 何斐 泮瑛瑛 张伟 徐灵芝

近来研究发现细胞外基质（ECM）并不只是细胞的支架，它还能动态调节各种细胞的功能和行为。ECM能结合生长因子、细胞因子、化学因子和细胞外酶，并调节它们的生物利用度和活性。此外，ECM蛋白可以直接和细胞表面受体作用，激发信号通路，从而调节各种细胞功能。ECM蛋白中有一种基质细胞蛋白（matricellular proteins），呈动态表达，但无明显的结构作用，主要调节细胞对环境刺激的反应。已知的基质细胞蛋白有血小板反应蛋白（thrombospondins），富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、hevin、骨桥蛋白（osteopontin）、结合腕蛋白（tenascin）C和X以及CCN家族成员。最近研究显示，CCN蛋白是胚胎发育所必需的调节因子，并在炎症、创伤修复、纤维性疾病和肿瘤中有重要作用。

最早发现的3个成员分别是CYR61、CTGF和NOV。由于CCN蛋白有很多名字，为减少不同名称造成的混乱，国际上按最早发现的3个成员的首字母缩写将其命名为CCN1-6。他们是脊椎动物中富含半胱氨酸的6个同源蛋白，有共同的结构模式，氨基端分泌肽后面紧接着4个保守的结构域，序列上分别和胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）、von Willebrand因子C型重复（vWC）、血小板反应蛋白I型重复（TSP）和含半胱氨酸结基序的羧基末端结构域（CT）相似。每个结构模块都是由保守的独立外显子编码，提示CCN基因是外显子改组的产物。蛋白中间有一个铰链结构，对蛋白水解特别敏感[1]。可能由于半胱氨酸残基含量很高(0～10%)，目前很难提取有生物活性的纯CCN蛋白。难以获得高质量的纯CCN蛋白以及对其生物活性和功能评价缺乏一个统一标准是阻碍研究进展的重要原因。由于蛋白制备方法不同，各个实验室结果可能存在不一致。对CCN功能的研究使得人们对ECM功能有更多的认识。

1 CCN蛋白的细胞受体和其调控的细胞功能

1.1 CCN蛋白的细胞受体

关于CCN蛋白的细胞受体目前比较明确的观点有：（1）CCN蛋白主要和包括整合素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)在内的细胞粘附受体结合而发挥作用。目前发现介导CCN功能的整合素至少包括α2β1、α5β1、α6β1、αvβ5、αIIbβ3、αMβ2和αDβ2。在某些条件下HSPGs作为整合素的辅助受体，与CCN之间也有强相互作用。（2）脂蛋白受体相关蛋白(LRPs)等一般情况下不和ECM蛋白结合的受体也能和CCN结合。（3）CCN和不同的整合素结合取决于目标细胞类型和介导的功能。（4）CCN蛋白上不同的整合素结合位点既可以相互协同，又可以独立完成不同的细胞效应。

1.2 细胞粘附、迁移和DNA合成

作为细胞粘附蛋白是CCN家族最显著和一致的功能。细胞在体外培养时贴壁生长，CCN蛋白和整合素以及与HSPGs结合启动粘附信号通路从而支持大多数粘附细胞的粘附。CCN蛋白还能作为桥接蛋白促进细胞粘附到其他ECM蛋白。CCN蛋白的另外一个独特功能是调节细胞迁移。CCN1、CCN2和CCN3蛋白可以促进很多干细胞迁移，但是过表达的CCN4和CCN5却抑制细胞迁移。CCN1、CCN2及CCN3都是微血管内皮细胞的化学趋化剂，这点与它们促血管生成作用是一致的。CCN2还有化学激动剂的作用。

CCN蛋白促有丝分裂的作用似乎取决于细胞类型。尽管CCN2能促进软骨细胞和成骨细胞的DNA合成[2]，但它是否能促进纤维母细胞的有丝分裂还是有争议的。早期研究认为CCN2能促进纤维母细胞的有丝分裂，然而其他研究显示CCN1、CCN2和CCN3单独作用时本身没有促进有丝分裂的能力，但是可以通过整合素αvβ3增强其他促有丝分裂生长因子的DNA合成作用。与此相反的是CCN5缺乏CT结构域，它的作用是抑制细胞增殖。

1.3 细胞生存和凋亡

很多细胞粘附到ECM会促进其生存，而脱离ECM则很快发生细胞死亡。因此CCN蛋白和不同细胞及不同整合素作用，既能促进细胞生存又能诱导凋亡，提示其可能在组织塑形中发挥作用。

1.4 血管发生

CCN1、CCN2和CCN3直接和整合素αvβ3结合促进内皮细胞粘附、迁移、增生和小管形成从而促进血管生成。CCN1促进整合素依赖的CD34+前体细胞招募而增强内皮细胞的增生和新生血管生成[3]，与此一致的是CCN1敲除小鼠有心脏缺陷。除了直接作用，CCN还能调节VEGF-A、VEGF-C等促血管生成因子的表达和活性[1]。CCN蛋白在胚胎发育、炎症和肿瘤发生中有重要作用，可能部分和其促血管生成作用有关[4]。

1.5 软骨和骨发生

动物模型和细胞培养实验显示CCN蛋白对骨形成有正负双向调节作用。CCN1促进成骨细胞分化抑制破骨细胞，提示在骨发生上有双向调节作用[5]。体外培养中CCN2可以促进原代成骨细胞的增殖和分化，小鼠实验中CCN2过表达则抑制成骨细胞功能从而导致骨质疏松[6]。

1.6 CCN蛋白和生长因子及细胞因子之间的相互作用及功能

通过功能性和/或物理性相互作用，CCN蛋白可以改变某些生长因子和细胞因子的作用。CCN蛋白可以改变TNFα在炎症反应中的作用。CCN1生物效应的发挥需多种受体参与，细胞上的受体可能决定了哪些细胞将被清除。CCN蛋白也可以调节生长因子的生物利用度和信号通路。CCN能促进和增强TGF-β功能，却抑制BMP的功能。

1.7 生长因子、激素和环境刺激调节CCN基因表达

CCN基因的表达受到各种环境刺激的影响，包括生长因子、激素、细胞因子、缺氧、UV和机械应力。这些基因对许多促有丝分裂信号和外部刺激高度敏感，包括成纤维生长因子、血小板衍化生长因子、佛波醇酯类和cAMP。TGF-β能强烈调控CCN基因表达，包括激活CCN1、CCN2、CCN4和CCN5的转录，抑制CCN3的表达。最近报道了一个新的调控机制，软骨细胞中基质金属酶MMP3和一个CCN2增强子结合能增强其表达，可能是通过转录子起作用[7]。MMP3在细胞内协同TGF-β激活CCN2启动子，提示MMP3和SMAD信号通路之间有相互作用。

一些激素也上调CCN表达。体外实验中血管紧张素Ⅱ增强VSMCs或鼠主动脉中CCN1的表达(Hilfiker et al，2002)。内皮素能上调成纤维细胞、VSMCs和心肌细胞CCN2的表达，与他们在纤维化疾病和心肌中的功能一致。CCN基因对环境刺激很敏感。暴露到紫外线下就可以诱导CCN1表达。低氧条件下在缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作用下可以诱导CCN和CCN2表达。HIF-1α和c-Jun/AP-1作用从而有助于CCN1在缺氧条件下的转录。对于CCN2，HIF-1α依赖的转录和通过3′UTR的一个序列元件增强mRNA稳定性均有利于缺氧状态下的CCN2的表达。机械刺激也能诱导CCN基因表达。成纤维细胞，软骨细胞和VSMCs在张力和压力作用下，内皮细胞在血流动力作用下，肾小球系膜细胞在静水压作用下均能快速表达CCN1和CCN2。应力能上调心肌和骨骼肌中CCN1和CCN2的表达[8]。在人体研究中发现，一次强力锻炼后机械应力能诱导骨骼肌表达CCN1和CCN2[8]。炎症和组织损伤也能诱导CCN表达。在出生后的发育和正常人体组织中，CCN蛋白通常都是低水平表达的，但是在炎症和损伤修复中表达升高。IL-1和TNFα等炎症细胞因子诱导CCN表达[9]，细菌和病毒感染也能诱导其表达[10]。

1.8 CCN蛋白在胚胎发育中的作用

敲除CCN1、CCN2、CCN3和CCN6等目标基因的小鼠模型都已经建立。除了CCN6敲除小鼠没有明显表型改变外，其他敲除小鼠的表型改变说明CCN在心血管和骨骼发育中有重要作用。敲除CCN1的小鼠在胚胎发育中出现致命的心血管畸形。CCN1敲除小鼠在发育的早期就死亡了，尽管胚胎死亡时还没明显的骨骼异常但无法准确判断胚胎晚期CCN1是否影响骨骼发育。CCN1和CCN2在活性和表达模式上有很多相似之处。尽管有相似之处，但在小鼠中分别敲除CCN1和CCN2后，却表现出了完全不同的表型。CCN1主要导致心血管系统异常，CCN2则主要导致呼吸系统畸形，以及严重的骨骼畸形。已经成功构建了敲除CCN3的小鼠，它们中也发现了CCN1和CCN2敲除小鼠中出现的缺陷，包括四肢和中轴骨缺陷、严重的关节畸形、心内膜垫重塑形异常伴心脏隔缺损。CCN3突变小鼠的晶状体中发现未成熟组织的退变，6个月以上的成年小鼠出现白内障。到目前为止基因敲除的小鼠中尚未发现神经系统表型异常，因此CCN蛋白对神经元细胞或神经系统发育的作用至今未知。

2 CCN蛋白在组织修复及其他疾病中的作用

2.1 伤口愈合

CCN蛋白参与很多组织的修复。在损伤修复早期，从血小板的α颗粒中释放出大量CCN2蛋白。CCN1和CCN2能直接与整合素αIIbβ3结合，支持血小板的粘附，并作为单核细胞等炎症细胞的粘附底物。在损伤修复晚期即组织塑形过程，CCN蛋白也是高表达的。此时CCN蛋白协同TGF-β对基质塑形，并可能与TNFα作用而触发纤维母细胞的凋亡[11]。长骨骨折时，骨痂中CCN1和CCN2的表达增加，这在增殖的软骨细胞和成骨细胞中尤其明显。抗体阻断CCN1后能抑制小鼠骨折的愈合[12]，鼠关节炎模型中重组的CCN2蛋白能促进关节软骨的修复。这些研究提示CCN蛋白在骨和软骨的修复中可能发挥重要作用。

2.2 CCN与纤维化疾病

CCN2过表达和各种器官的纤维化有紧密联系。在皮下单独注射TGF-β或CCN2只能短暂诱导肉芽组织生成，而联合应用TGF-β和CCN2则产生持续的纤维化反应。推测认为TGF-β只是启动纤维化反应，CCN2则协同并增强TGF-β的作用。CCN2在肝脏纤维化和系统性硬化中有重要作用。用小干扰RNA敲除CCN2后可以阻止CCl4诱导的鼠肝脏纤维化[13]。肝硬化和纤维化的动物模型和病人中均发现纤维间隔中星状细胞的CCN2表达升高。在体外，CCN2支持肝脏星状细胞和椭圆形细胞的粘附，刺激星状细胞增殖和椭圆形细胞的迁移[14]。此外，在系统性硬化或硬皮病中CCN2是显著高表达的。人CCN2蛋白启动子的多态性和硬皮病显著相关[15]。这些研究结果强调了CCN2在纤维化中的重要作用，提示CCN2可能是抗纤维化的潜在治疗靶点[16]。

2.3 糖尿病肾病

小鼠足细胞CCN2过表达会加重糖尿病肾病提示CCN2在此疾病中有重要作用[17]，而用反义寡核苷酸减少CCN2的表达能减轻肾脏纤维化及减轻糖尿病小鼠的肾病[18]。在体外，CCN2促进肾小球系膜细胞的存活，刺激基质沉积，抑制高糖对基质的退变作用。近来一些独立研究显示血浆或肾脏中的CCN2水平是糖尿病肾病的一个有用指标[19-20]。

2.4 血管疾病

CCN1和CCN2在动脉粥样硬化灶的VSMC和球囊血管成形术后再狭窄病灶中过表达。用小干扰RNA或FOXO3a抑制CCN1表达可以减少球囊血管成形术后新生内膜增生，用转基因技术再次增加CCN1表达可以逆转此结果[21-22]。这些结果强调CCN1在血管修复方面的重要作用，提示抑制CCN1可能可以预防血管手术后的再狭窄[22]。

2.5 肿瘤

大量的研究工作支持以下观察：（1）很多组织来源的肿瘤都有CCN的异常表达。（2）CCN基因的异常表达对肿瘤有促进或抑制作用，取决于肿瘤类型。（3）在有些肿瘤中，抗CCN治疗可以抑制肿瘤的生长或转移。（4）CCN基因表达情况可以作为很多肿瘤的诊断或预后指标[22-24]。

CCN促进肿瘤生长的一个可能机制是促进肿瘤血管生成。CCN促进肿瘤生长的另外一个机制是增强肿瘤细胞的生存能力。矛盾的是，CCN蛋白也可以抑制肿瘤的生长。例如，CCN1抑制裸鼠中非小细胞肺癌的生长。CCN2通过CRMP-1依赖方式抑制肺腺癌的转移和侵袭，抑制结肠直肠的肿瘤的转移。能调节IGF信号的CCN6能抑制炎性乳腺癌的生长[24]。

CCN蛋白的抗血管和凋亡活性方便可以促进或抑制肿瘤生长，CCN蛋白在肿瘤中的作用是复杂的，可能涉及多个下游效应器。理解CCN蛋白如何促进或抑制肿瘤生长还需要进一步的研究。虽然如此，各种肿瘤中和CCN蛋白之间存在很强的相关性提示此蛋白是一个有价值的预后因子，CCN信号通路可能是一个新的抗肿瘤靶点。

3 结论和展望

目前认为CCN家族蛋白是一个和发育及损伤修复有关的ECM相关性多功能调节因子。在细胞水平，CCN蛋白直接与整合素结合发挥作用，有些情况下需HSPGs和LRPs起协同受体作用。CCN调节细胞粘附、迁移、增殖、分化、凋亡、生存。此外，他们还与包括TGF-β、TNFα、VEGF、BMPs，及Wnt家族成员在内的生长因子和细胞因子相互作用并调节它们的生物利用度和（或）活性，从而具有广泛的作用。CCN蛋白是血管生成和软骨发育的有力调节因子，在损伤修复、纤维疾病和肿瘤中也发挥重要作用。最近研究强调他们作为细胞粘附分子既能促进细胞死亡又能促进细胞存活，还能复杂地调节TNFα等炎症细胞因子的细胞毒性作用。尽管已知在生理条件下CCN1可以调节TNFα，CCN蛋白在炎症中的作用还没有得到彻底的研究；尽管CCN蛋白的功能性结构域已经被描绘出来了，而且一些特定整合素结合部位已经被确定，但它的三维结构仍然不清楚。CCN蛋白中半胱氨酸残基含量异乎寻常地高，提示这可能是一个明显影响其功能的结构。

到目前为止基因打靶研究确定了CCN蛋白在心血管和骨骼发育中的关键作用。但是由于小鼠敲除CCN1或CCN2后在胚胎发育期或出生前后就死亡了，因而无法得知它们在发育晚期及疾病过程中的作用。因此，在特定组织或一定条件下消除CCN基因才能揭示它们在特定器官和组织中的作用。此外用突变的等位基因替换正常的CCN基因，从而消除CCN与特定受体或蛋白的结合能力的等位基因置换法可能可以说明CCN。

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