细胞凋亡的主要检测方法研究进展

张广智,胡长敏,陈颖钰,刘 颖,李 帅,罗 雨,王金勇,郭爱珍*,3,陈焕春

(1.华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070;2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070;3.国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室,湖北武汉 430070)

细胞凋亡的主要检测方法研究进展

张广智1,2,胡长敏1,3,陈颖钰1,2,刘 颖1,2,李 帅1,2,罗 雨1,2,王金勇1,2,郭爱珍*1,2,3,陈焕春1,2

(1.华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070;2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070;3.国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室,湖北武汉 430070)

细胞凋亡是生理性细胞死亡过程,凋亡在维持动物机体内环境平衡中扮演着极其重要的角色。细胞凋亡的准确检测是研究细胞凋亡相关机制,以及评价细胞凋亡在相应组织或疾病中影响的第一步。形态学是检测细胞凋亡的最直观的方法,至今一直作为细胞凋亡检测的金标准。DNA片段化检测主要有DNA ladder,T UNEL检测法和ELISA检测法。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡的早期事件。凋亡相关基因的检测包括促凋亡基因的检测和抑制凋亡基因的检测。流式细胞术检测细胞凋亡是近些年发展的简单快捷的方法,即可定性又可定量。Ca2+作为细胞内重要的信号分子其浓度和细胞凋亡关系密切相关。

细胞凋亡;线粒体膜电位;流式细胞术

*通讯作者

细胞凋亡是由基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡的特征是具有明显的形态学改变,包括细胞膜发泡,细胞皱缩,线粒体膜电位下降,染色体凝聚和DNA片段化等[1]。近年研究表明,细胞凋亡在疾病的发生、发展中起着非常重要的作用。研究表明,机体内细胞凋亡是受多基因精细调控的结果[2],过量或者过少的细胞凋亡均对机体有害。人类及动物的多种疾病的发生发展均与细胞凋亡密切相关,如果能恰当的阻断或加速细胞凋亡,可以为治疗或防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径[3]。细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的必需步骤,凋亡的所有检测方法是基于凋亡细胞所特有的形态学和生物化学特征建立的。

1 细胞凋亡的形态学检测

细胞发生凋亡时具有固有的形态特征,如细胞核表现缩小、染色质边缘化、凝集,凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体[4]。DNA特异性染料(如 Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合,从而使细胞核着色,在紫外光激发时会出现明显的荧光[5]。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可以观察细胞染色质的形态学变化、膜结构及通透性的改变,从而鉴别凋亡细胞、正常细胞及坏死细胞。细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测[6]。

2 细胞凋亡的DNA片段化检测

2.1 DNA ladder

提取凋亡细胞的基因组DNA,经电泳后染色观察可见180 bp～200 bp及其不同倍数的弥散状DNA条带,即DNA ladder。DNA ladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶电泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。

2.2 T UNEL检测法

T UNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180 bp～200 bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3′-OH的末端,依次加入 HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色[7]。T UNEL法因其灵敏高而被广泛用于各种凋亡细胞的检测,由于在坏死细胞内也可能存在DNA片段化,所以只有DNA链普遍断裂才能证明细胞发生凋亡。另外,在TUNEL法具体试验操作过程中,需要摸索细胞的固定及消化时间,以提高该技术的敏感性和获得较低的背景值[8]。

2.3 ELISA检测法

应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度[9]。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内,进而导致结果偏高,因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件。

3 细胞凋亡的线粒体膜电位的检测

细胞发生凋亡过程中,线粒体也会发生变化。线粒体通透性转换孔的开放导致的线粒体膜通透性发生变化,此被认为是线粒体导致细胞死亡的众多途径中关键的一个[10]。研究证实细胞在凋亡刺激信号的刺激下线粒体膜电位发生下降[11],线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件,而且细胞聚集染料能力的下降可以用来反映膜电位的下降程度,进而通过流式细胞术检测线粒体内跨膜电位的变化。许多种染料可以用来检测线粒体膜电位,染料的选择取决于所用的激发光。常用的膜渗透性亲脂性阳离子染料包括罗丹明123、JC-13、3′-二己基恶碳箐(3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide)和氯乙基红(chloromethyl-X-rosamine)等[12]。除了用流式细胞术检测线粒体膜电位外,也可以通过荧光显微镜来观察。由于该方法不能区分是否由于细胞凋亡导致的线粒体膜电位的变化,所以只能作为细胞凋亡检测的补充方法。

4 细胞凋亡相关的基因检测

4.1 凋亡促进基因表达的检测

caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行 caspase。启动 caspase包括caspase 8、9、10,执行 caspase 包括 caspase 3 、6、7。其中caspase 8和 10外源性细胞凋亡的启动者,caspase 9是内源性细胞凋亡的启动者[13]。启动caspase是经过和其他凋亡相关分子结合后自激活的,执行 caspase是被启动 caspase激活后,执行caspase经过一系列的酶激活级联反应,导致最后细胞凋亡[14]。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促进基因的表达情况[15]。

4.2 凋亡抑制基因表达的检测

通常在检测细胞凋亡试验中,除检测凋亡促进基因的表达外,还会同时检测抑制凋亡基因的表达情况来反映细胞凋亡,如核因子-κ B(NF-κ B),环氧合酶(COX)和 BCL-2家族成员等基因。NF-κ B是调节细胞基因转录的关键因子,它参与了多种凋亡相关基因的表达,目前已发现NF-κ B可促使某些抗凋亡基因表达上调。COX定位于内质网附近并普遍存在于多种组织细胞内,发挥其“看家”作用,促使生理性前列腺素的合成,以维护细胞自身稳定和调节正常组织细胞的一些生理活动[16]。Bcl-xL和Bcl-2是BCL-2家族中的成员,它们在抗凋亡中均发挥了重要的作用,但在不同的细胞类型和不同的死亡信号作用过程中,两者发挥的作用并不相同[17]。而且当细胞内BCL-2抗凋亡成员的表达量增加时,线粒体通透性的改变和促凋亡蛋白的释放所带来的促凋亡作用可以被其抵消掉[18]。Beevi S S等[19]用RT-PCR检测促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达,进而确定了胡萝卜提取物对人类癌细胞增殖和凋亡的影响。

5 细胞凋亡的流式细胞术检测

5.1 细胞周期的测定

鉴于细胞凋亡后发生DNA断裂,根据此特征应用 DNA结合染料,如碘化丙啶(Propidium iodide,PI)、吖啶橙(Acridineorange,AO),或 Hoechst dyes等进行细胞周期的检测,判定细胞凋亡的程度和比率。由于DNA小片段溢出的程度受反应时间、温度等影响,需要通过调整凋亡细胞的DNA含量,减少凋亡细胞与非凋亡细胞的重叠峰,进而增加试验结果的可靠性[12]。Feng Qian等[20]用多种方法检测京尼平引起的人白血病细胞系K562细胞凋亡,并用PI染色观察细胞周期的分布。

5.2 Annexin V/PI双染法测定

Annexin V/PI法是根据细胞凋亡早期细胞膜的磷脂对称性发生改变,磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内移位到细胞膜外,采用Annexin V/PI双染,并通过流式细胞术测定细胞凋亡的方法。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,Annexin V对PS具有高度的亲和性,正常细胞表现为Annexin V-/PI-,坏死细胞表现为Annexin V+/PI+,凋亡细胞表现为Annexin V+/PI-,而机械性损伤细胞表现为Annexin V-/PI+[21]。武发菊等[22]通过对比发现吖啶橙和溴化乙锭双重荧光染色法是定性测定细胞凋亡的较为可靠的方法,而FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞仪是较为理想的凋亡定量检测方法。这两种凋亡检测方法的联合应用比较适应于动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测。需要注意的是,在采用Annexin V/PI和Hoechst 33342/PI这两种方法测定细胞凋亡都要保持细胞膜的完整性,因此在处理和细胞相关的步骤时要减少对细胞膜可能造成的损伤,比如要避免用乙醇和多聚甲醛的固定细胞,对于贴壁细胞,胰酶消化时间不宜过长等。。

6 细胞凋亡的Ca2+浓度变化的测定

Ca2+是细胞中一种十分重要的第二信使分子,细胞众多的生命活动都有Ca2+的参与。关于Ca2+在细胞凋亡中的精确作用还存在很多的争议,但目前的一致结论是:内质网Ca2+丢失会引发内质网压力途径的细胞凋亡发生,压力诱发的Ca2+过多负载会导致更多的坏死,调节性Ca2+浓度的增加在内源性细胞凋亡途径中提供了重要的信号事件[23]。目前有多种方法可以用来测定胞浆内Ca2+的变化,应用Ca2+特异性荧光探针,如 Rhod-2、Indo-1、Fura-2、Fura-3和Quin-2对细胞进行标记后,通过流式细胞术分析,不仅能检测出细胞群体异质性,并能对多项生化指标进行测定,故该法具有较高的优越性。Jae Kyoo Lee[24]等通过Fluo-4荧光标探针检测在特定压力条件下细胞凋亡中Ca2+浓度的动态变化。

7 结语

细胞凋亡的检测方法都是基于细胞凋亡过程中的各种特征设计的,在进行细胞凋亡检测的时候,要综合几种方法进行检测,因为目前没有一种细胞凋亡的检测方法是完美的,任何一种方法都是有局限性的。不同时间检测细胞凋亡得到的结果也不一样。因此,要想捕捉到明显的细胞凋亡,就要设置不同条件进行检测,比如刺激时间梯度和刺激源浓度梯度等。另外,针对不同时期的细胞凋亡情况的检测,要选择不同的检测方法,比如要测定细胞早期凋亡,就要选择Annexin V/PI法,线粒体膜电位的测定等;而形态学检测,如 DNA ladder、TUNEL等检测方法主要是针对细胞中晚期凋亡。因此,只有用几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果,才能真正的反映细胞发生凋亡的情况,进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制的深入了解,操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多。

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Recent Advance on the Ways to Apoptosis Detection

ZHANG Guang-zhi1,2,HU Chang-min1,3,CHEN Ying-yu1,2,LIU Ying1,2,LI Shuai1,2,LUO Yu1,2,WANG Jin-yong1,2,GUO Ai-zhen*1,2,3,CHEN Huan-chun1,2

(1.College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Huber,430070,China;
2.The Stated K ey Laboratory of Agricultural Microbiology,Wuhan,Huber,430070,China;
3.National beef Cattle Industrial Technology Sy stem,Wuhan,Huber,430070,China)

Apoptosis is a programmed,physiological mode of cell death that plays an important role in maintaining the homeostasis of internal environment.The accurate detection of apoptosis is the first step to analysis the relative mechanisms of apoptosis and to assess the impact of apoptosis on the respective tissue and the disease.Morphologic is the most intuitionistic method to detect the cell apoptosis,and is still considered to be golden standard.DNA ladder,TUNEL,and ELISA are used to detect the DNA fragmentation.The decrease of mitochondria membrane potential is the early event of cell apoptosis.The detection of apoptosis-related genes include the proapoptosis genes and anti-apoptosis genes.Flow cytometry is a easy and fast method developed in recent years to detect the cell apoptosis,and it can be used for qualitative and quantitative analysis of apoptosis.As a important signal molecular,the concentration of Ca2closely related to cell apoptosis.

cell apoptosis;mechanism mitochondria membrane potential;flow cytometry

S852.3

A

1007-5038(2011)08-0089-04

2011-02-13

现代农业(肉牛)产业技术体系(nycytx-38)建设专项资金资助;公益性行业(农业)科研专项基金资助(201003060);华中农业大学自主创新基金项目资助(2010QC002)

张广智(1983-),男,河北衡水人,硕士研究生,主要从事反刍动物传染性疾病子研究。