顶复门原虫与细菌Ⅱ型丙二酰单酰辅*酶A:ACP转酰基酶研究进展

孙铭飞,廖申权,吴彩艳,戚南山,吕敏娜,袁健丰,于劲术,蔡建平

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州 510640)

顶复门原虫与细菌Ⅱ型丙二酰单酰辅
*酶A:ACP转酰基酶研究进展

孙铭飞,廖申权,吴彩艳,戚南山,吕敏娜,袁健丰,于劲术,蔡建平*

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州 510640)

大部分顶复门原虫与人畜重要寄生虫病密切相关。近年来,由于各类药物在寄生虫与细菌病防治中的广泛应用,甚至是滥用,造成了这类寄生虫与细菌的严重抗药性,急需一些新型抗感染性药物的出现。由于在一些顶复门原虫与细菌中广泛存在的Ⅱ型脂肪酸代谢途径在其脊椎动物宿主中并不存在,而丙二酰单酰辅酶A:ACP转酰基酶(malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)是由mcat基因编码的一种巯基酶,负责在起始步骤把丙二酰基团从丙二酰单酰CoA上的硫酯连接部位转移到ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂上而形成丙二酰单酰ACP,对于顶复门原虫和细菌的脂肪酸合成代谢至关重要,成为研究开发药物的理想靶位。文章对ACP转酰基酶的研究进展进行了综述。

顶复门原虫;细菌;丙二酰单酰辅酶A:ACP转酰基酶

*通讯作者

传统的抗感染特别是抗寄生虫药物筛选方法是“化学筛选”,这一筛选方法不仅费时、费力,而且筛选出的药物,即使在临床上使用多年,对其抗寄生虫和抗菌机理仍不清楚,故而当抗药性出现的时候人们束手无策,无法根据其药靶分子的结构特征进行药物的结构改造来延续药物使用[1-6]。上世纪60年代,人们逐步认识到药靶和药物相互作用的重要性,开始基于药靶分子结构进行药物合理设计和创制的系统研究。组合化学理论和技术的出现,使人们能根据对药靶分子的结构研究,利用化合物库进行大量筛选。随着高通量筛选技术(H TS)的飞速发展,组合化学技术与之有机结合更大大提高了药物开发的能力与速度,成为新药创制研究的重要手段[7-8]。

脂肪酸不仅是所有生物的主要能量来源,而且也是生物膜不可或缺的组成成分[4]。现已证实,在不同的生物体内具有两种不同的脂肪酸代谢途径。在人、哺乳动物和禽类的脂肪酸合成酶是被融合成一个多功能的单个多聚肽而存在于胞浆中,这种代谢途径称之为Ⅰ型脂肪酸代谢途径;在细菌和植物,这些酶是独立的单功能的蛋白,称之为Ⅱ型脂肪酸代谢途径[5-6]。

真菌、细菌和顶复门原虫Ⅱ型脂肪酸合成途径的催化酶在空间结构和酶学特征上显著区别于高等动物的I型脂肪酸合成酶(系),是研究开发抗这类病原体药物的理想靶标[8-11]。MCAT作为该代谢途径中的关键酶,已成为近年来抗菌、抗原虫及抗真菌药等研究的焦点问题之一。

丙二酰单酰辅酶 A:ACP转酰基酶(Malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)是由mcat基因编码的一种巯基酶,在Ⅱ型脂肪酸合成途径中起着极其重要的作用,负责在起始步骤把丙二酰基团从丙二酰单酰CoA上的硫酯连接部位转移到ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂上而形成丙二酰单酰ACP[1,12]。

丙二酰单酰ACP是脂肪酸代谢过程中的核心物质,是酮酯酰ACP合成酶(KASI/II/Ⅲ)进行脂肪酸链延伸进一步合成脂肪酸的底物[1,12]。此外,最近的研究显示,MCAT可能还参与多聚酮的生物合成,因此被认为是脂肪酸和多聚酮2个代谢途径的结合点[13-15]。早期Harder等人筛选了温度敏感的大肠埃希菌(Escherichia coli)fabD89突变株,在Ecmcat基因上存在一个琥珀突变[16],在温度高于39℃时Ecmcat基因停止表达,致使E.coli不能正常合成生长所必需的脂肪酸,使其不能在无饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的培养基上生长[16],也间接证明Ecmcat基因对于E.coli生存的必要性[16]。这些证据充分显示了MCAT在Ⅱ型脂肪酸合成途径中的重要性,可以作为药物开发的分子靶标。

为此,MCAT激发了人们极大的研究兴趣,对多种生物MCAT的研究已经取得了很大的进展。

1 Ⅱ型mcat基因分析

自1992年Verwoert等克隆了E.coli的mcat基因以来[17],已经在多种细菌如结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、 天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginaosa)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[15,18-23],植物如玉米(Zea mays L)、欧洲油菜(Brassica napus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、 花 生 (Arachis hypogaea)[24-27]和顶复门原虫(恶性疟原虫,Plasmodiumfalciparum;柔嫩艾美耳球虫,Eimeria tenella)[12,28]等多种生物中发现了mcat基因的存在。通过多重序列比对分析发现,这些基因所编码的氨基酸序列具有较高的相似性,各物种之间的同源性在20%～33%之间;所编码的氨基酸都存在“GXSXG”和“GQGXQ”两个高度保守的moti f;并且通过结构信息分析也证实这两个moti f与MCAT的功能密切相关[18,12,15,17]。

虽然不同物种的MCAT具有许多相同特征,但是部分MCAT也存在序列特异性。P.falciparum作为顶复门原虫中到目前为止唯一发现mcat基因的生物,在其长度为1 224 bp cDNA序列5＇端的一段序列与细菌对应的基因明显不具有同源性;利用生物信息学分析结果显示1～309 bp编码了一个103个氨基酸的引导肽;其中利用SignalP软件预测显示1～31个疏水性的残基具有明显的信号肽特征,其后是一段酸碱性交替出现的残基(F32-N53,pI=6.2;K54-K73,pI=10.7;G74-Y103,pI=5.7),具有PfMCAT转导肽序列特征。目前认为PfMCAT的引导肽(包括信号肽和转导肽)功能仅仅是引导由核基因编码的PfMCAT向效应靶亚细胞器顶质体(apicoplast)的转运,与成熟 PfMCAT的功能无关[12];2003年Prigge等人体外重组表达了去除1～103个引导肽序列的成熟 PfMCAT蛋白,生化试验证实这一无转导肽的重组蛋白仍然具有MCAT的完整功能[12]。此外,在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)数据库网站已经注释了一个编号为42.m03469编码TgMCAT的基因序列,分析结果显示这个基因也同样具有引导肽序列(包括信号肽和转导肽),预测其在T.gondii的顶质体内发挥作用(http://www.ToxoDB.org)。

与PFMCAT基因相似的还有一些植物的MCAT基因(如 B.napus;A.thaliana等),这些植物的Ⅱ型脂肪酸合成场所也是一个与顶复门原虫相似的亚细胞器质体(plastid),这一类植物的MCAT基因同样有部分序列编码了plastid靶向的引导肽(信号肽和转导肽[2,12,26,28]。

此外,2006年Huang等报道M.tuberculosis和M.avium不仅存在类似于大多数细菌的Ⅱ型mcat基因,同时还存在另外一个仅仅编码224各氨基酸的mcat2基因。结核分支杆菌的mcat2基因与mcat基因所编码的氨基酸序列仅仅有28%的同源性,并且不具有其他Ⅱ型 MCAT都高度保守的“GXSXG”motif;但是利用重组MtMCAT2进行生化分析显示,MtMCAT2同样可以利用E.coliholo-ACP和丙二酰单酰辅酶A作为底物,具有与Mt-MCAT相同的催化活性,推测MtMCAT2可能利用其他氨基酸残基代替了MtMCAT丝氨酸活性位点的作用[29]。

2 Ⅱ型MCAT的结构与作用机制

自1995年Serre等报道了E.coliMCAT的结构以来[30],目前已经有多种生物MCAT的结构信息被解析(S.aureus[15],S.coelicilor[31],M.tuberculosis[32],H.pylori[33])。不同物种 MCAT的结构在整体上都是极其相似的,每一个MCAT单体都是有2个亚结构域组成。在N端由多个b折叠和a螺旋组成的大亚基结构域,其核心结构与a/b水解酶极其相似;在C端有一个类似于铁氧还原蛋白折叠的小亚结构域。这些酶都具有两个与其生物学功能密切相关的保守motif,一个是在两个亚结构域中间形成的“深沟”(deep gorge)内(malonyl-CoA结合位点),另外一个位于MCAT表面的ACP结合位点[30-33]。

在E.coliMCAT上,3～123和206～307位2个不连续的残基段组成了一个较大的亚结构域,124～205位的一段氨基酸残基组成了较小的亚结构域。其活性中心位于两个亚结构域中间形成的“深沟”(deep gorge)内,对于EcMCAT功能至关重要的亲核基团Ser92位于大亚结构域上的一个a螺旋--b折叠的转角处,通过氢键与His201上的Ne2结合形成His-Ser二联体,对EcMCAT上Ser92的突变分析显示,Ser92突变的EcMCAT完全不具有活性;虽然E.coliMCAT大亚结构域的核心结构与a/b水解酶极其相似,但二者的作用机制却明显不同,MCAT的酰基--酶中间态是稳定的,而当水分子亲核基团通道进入水解酶中间态的活性位点时,其中间态快速解离并释放出第一个产物[30,34]。

其他物种MCAT总体上都与E.coliMCAT相似,但在某些细节方面仍存在一些差异。2003年Keatinge-Clay等对S.coelicolorMCAT的晶体结构进行了分析,结果显示,两者最大的不同就是在其大亚结构域上第7个a螺旋由于增加1个转角而延伸,第9个a螺旋变的更短,靠近C末端的第14个a螺旋增加了2个转角进一步增长[26]。虽然Ser97-His201(以S.coelicilor的序列)形成二联体,但是这两个残基突变之后的重组蛋白仅仅是降低了ScMCAT的活性而不是完全失活,与EcMCAT具有明显差异。这也暗示在S.coelicilor中 Ser97和His201并不是其功能所必需的氨基酸残基,有其他的残基起到与EcMCAT上Ser92相同的功能[34]。

在2007年Zhang和 Li等人分别对H.pylori和M.tuberculosis的晶体结构进行了解析。H.pyloriMCAT结构与E.coli和S.coelicilor差别不大,只是在某些方面有些不同[32,33]。(1)在 E.coli(Pro52-Glu55)和S.coelicilor(Asp49-Glu52)都形成1个a螺旋的位置,在HpMCAT对应的地方却是一个loop。(2)在H.pyloriMCAT中的第8和第9两个a螺旋在EcMCAT和ScMCAT对应的是个长的a螺旋。(3)HpMCAT中的第7个b折叠在EcMCAT对应的却是一个loop。(4)HpMCAT中的第7个b折叠(Ala233)在EcMCAT和ScMCAT找不到对应的结构[33]。而MtMCAT的晶体结构与以上这些物种的MCAT结构相比在某些亚结构上却有很大的差异,MtMCAT Ser91(以M.tuberculosis的序列)的Cβ-Oγ键与其他MCAT结构相比向上翻转引起不同的导向,从而引起“活性口袋”结构的改变。另外,His194(以M.tuberculosis的序列)并不参与形成Ser-His二联体,而仅仅起到稳定底物的作用[32]。

目前认为MCAT通过ping-pong bibi机制把丙二酰基团从丙二酰单酰CoA上的硫酯连接部位转移到ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂上而形成丙二酰单酰ACP,这个反应分为两步来进行[30-34]。以E.coli为例,第一步是把丙二酰单酰CoA上的丙二酰基团转移到活性位点Ser92上,His201激活Ser92亲核黏附于形成的硫酯上,第二步是His201激活ACP上的巯基亲核黏附于丙二酰基团-Ser92的中间体上,此时丙二酰单酰辅酶A上的CoA基团释放出来;在此过程中Gln11和Leu93等残基形成了一个氧离子洞,通过稳定这个四面体中间复合物的负电荷来促使丙二酰基团向ACP巯基上的转移形成最终的产物丙二酰单酰ACP[30-34]。

3 Ⅱ型MCAT与抗感染药物研发

虽然细菌和一些植物以及顶复门原虫分属于低等的原核生物和相对高等的真核生物,但是两者之间的种系进化关系差别较大。由于这些物种的脂肪酸代谢同属于 Ⅱ型脂肪酸合成代谢途径,其代谢相关酶在结构和功能上又都是高度相似的。目前,已有多个研究小组还利用不同物种的MCAT基因来互补E.coli的温度敏感的MCAT突变株(E.coli fabD89)使其在39℃恢复生长。1998年Simo等人用B.napus从文库中筛选到一个与E.colimcat基因同源的BnMCAT,并利用这个基因片段构建表达载体,转化到E.coli fabD89突变株,利用BnMCAT互补其ECMCAT基因缺失的功能,能够使其在39℃恢复生长[25];1995年Verwoert利用同样的方法验证了一个玉米ARF蛋白家族GTP绑定蛋白可以互补E.colifabD89突变株ECMCAT基因缺失的功能[24]。1998年Zhang等,2002年Soto等利用同源重组置换的方法分别用S.typhimurium和S.meliloti的MCAT基因片段整合到E.colifabD89突变株染色体上,替换其带有琥珀突变的Ecmcat基因,结果显示异源等位基因替换后的E.coli突变株能够在39℃生长[22-23]。这些结果不仅仅能够证明不同物种之间MCAT基因功能的相似性,更显示出MCAT对E.coli的必需性,具有作为开发新型药物靶标的前提条件。

在这些研究成果的基础上,2006年Liu等人在HpMCAT的研究中取得了让人惊喜的突破,通过HpMCAT的抑制动力学筛选天然化合物库已经发现一种植物天然提取物紫堇块茎碱(Corytuberine)能够有效的抑制H.pylori MCAT的活性[12,23](IC50=33 ±3.29 μ mol/L);进一步的研究显示 ,Corytuberine是通过反竞争的机制抑制HpMCAT的活性[20]。2008年Kong等人证实胡桃醌(juglone)不仅能够抑制 H.pylori胱硫醚 γ合成酶(cystathionine-synthase)和 β酮酯酰 ACP脱水酶(βhydroxyacyl-ACP dehydratase)的酶活性,而且可以通过抑制MCAT而使 H.pylori活性丧失,具有研制成为新型抗感染药物的前景[7]。

作者所在课题组利用当代生物信息学和比较基因组学技术注释得到与柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)Ⅱ型脂肪酸合成代谢途径的关键酶:丙二酰单酰辅酶A:ACP转酰基酶(Malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)基因序列[28]。利用整合自杀质粒介导的同源重组方法将E.coli mcat温度敏感突变株(E.colifabD89)的ECMCAT基因功能性置换为去除信号肽和转导肽的ETMCAT,成功构建了一个带有EtMCAT的E.coli重组菌,此重组菌在E.coli f abD89的非适应温度下(39℃)能够恢复生长,初步证实EtMCAT与EcMCAT具有相同的功能。利用分子生物学技术获得了具有酶活性的重组蛋白,并对其酶动力学和抑制动力学性特征进行了详细研究,EtMCAT对Malonyl-CoA的Km=22.8±4.04 μ mol/L,对 holo-ACP 的 Km=20.7 μ mol/L±4.62 μ mol/L,Vmax=549.76 ±6.96 nmol/min;同时也发现,Corytuberine不仅是EtMCAT的有效抑制剂(IC50=16.47±2.38 μ mol/L),并且在细胞培养模型上Corytuberine也能够有效抑制球虫子孢子的入侵(课题组未发表资料),这些研究资料都更进一步说明MCAT可以作为开发新型抗感染性药物的靶标,必将成为这一领域的研究焦点。

4 小结与展望

虽然MCAT的研究取得了诸多的进展,但是必须看到的是这些成果主要集中与少数的细菌等一些原核生物,在顶复门寄生虫上至今为止仅仅对P.falciparum的MCAT进行了初步的研究,目前对于其他的重要顶复门原虫如T.gondii、艾美耳球虫(Eimeria spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、微孢子虫(Microspora spp.)、环孢子虫(Cyclosporidium spp)等MCAT的研究几乎一片空白。

鉴于目前抗菌、抗真菌及抗寄生虫药物已经呈现严重耐药性的现状,借鉴现有的研究成果,系统地研究顶复门原虫与细菌已被证实极其重要的药物作用靶标--Ⅱ型MCAT,必将能够为研发新型抗菌、抗真菌及抗寄生虫药物提供新的思路。

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Adcance on TypeⅡMalonyl-CoA:Acyl Carrier Protein Transacylase in Apicomplexa and Bacteria

SUN Ming-fei,LIAO Shen-quan,WU Cai-yan,QI Nan-shan,LV Minna,YUAN Jian-feng,YU Jinshu,CAI Jian-ping

(Institute of Veterinary Medicine,Guangdong Academy of Agricultural Sciences;Guangdong Common Lab of Veterinary Public Health;Guangzhou,510640,China)

Apicomplexan parasites cause high impact diseases in humans and animals.Current drugs are not efficacious,cause serious side effects,and are becoming less useful because of increased resistance to them.T herefore,there is an urgent need to develop new drugs against parasites and bacterial.Like in plants,fatty acid biosynthesis in apicomplexa and bacteria is mediated by a type II system.Since animals only possess type I enzymes,the distinct type II synthetic pathway naturally become an attractive target for chemothera-peutic intervention.MCAT is essential for fatty acid synthesis,which uses a ping-pong kineticmechanism with an bound malonyl ester as the acyl enzyme intermediate attached to a serine residue residing,would be an excellent target for antibacterial,antifungil and anticoccidial drugs discovery.

apicomplexa;bacteria;malonyl-CoA:acyl carrier protein transacylase

Q55

A

1007-5038(2011)08-0080-05

2011-01-17

国家自然科学基金项目(30471300);广东省国际科技合作专项(2008A050200015);广东省自然科学基金项目(1045106001006126);广东省农业科学院院长基金项目(201014)

孙铭飞(1978-),男,河南沈丘人,博士,助理研究员,主要从事球虫生化代谢与入侵机制研究。