狂犬病病毒致神经功能异常机制的研究进展*

单晶辉,关振宏,段 铭,张茂林

(人兽共患病研究教育部重点实验室 吉林大学人兽共患病研究所,吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062)

狂犬病病毒致神经功能异常机制的研究进展*

单晶辉,关振宏,段 铭,张茂林*

(人兽共患病研究教育部重点实验室 吉林大学人兽共患病研究所,吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062)

狂犬病是一种以神经系统感染为特征的高度致死性人兽共患病毒性传染病,危害大,但其致病机制尚不明确。狂犬病病毒(RV)G蛋白与神经细胞表面受体发生特异性结合决定其嗜神经特性,其他RV结构蛋白对RV感染具有保护和调节作用;机体感染RV后神经元结构和机体内与功能相关的部分蛋白及基因表达水平发生改变,而且RV在神经核的分布可能影响神经通路的正常功能,推断这些变化可能是出现神经症状和造成动物死亡的主要原因。论文综述了RV感染导致神经功能异常的研究近况,以期为阐明RV致神经功能异常机理奠定基础。

狂犬病病毒;神经功能异常;致病机制

*通讯作者

狂犬病病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus),是单股不分节负链 RNA。血清学方法将狂犬病病毒属分为4个血清型,Ⅰ型病毒有古典RV、街毒和疫苗株,血清Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型病毒为狂犬病相关病毒,其原型株分别为Lagos bat、Mokola和 Duvenhage病毒。狂犬病每年约造成全球超过55 000人死亡[1]。我国人狂犬病流行的主要原因是养犬数量多,而犬免疫覆盖率较低;RV感染犬的广泛存在成为我国人狂犬病的主要传染源[2]。感染者一旦发病,可表现出明显的神经症状[3]。RV糖蛋白可与神经细胞表面受体特异性结合,因此RV具有神经嗜性,可以在肌肉-神经元之间传播。推断由于RV对细胞表面受体的影响,导致神经细胞受体的浓度发生改变,进而影响神经功能;还可能导致细胞离子通道紊乱,从而影响神经元的生理并进一步导致神经元功能性损伤。神经嗜性、神经侵袭性及神经功能损伤不仅是RV感染的显著特征,也是病毒引起病理变化的基础。由于缺乏对RV致神经功能异常机制的准确认识,最终发病者几乎100%死亡,因此对RV感染导致神经功能异常机制的研究,不仅可加深对该病的认识,而且可为发病者的临床干预提供重要依据。

1 细胞表面受体介导RV感染

RV G蛋白识别神经细胞表面受体,可以在肌肉-神经元之间传播,因此RV具有神经嗜性。乙酰胆碱受体(Nicotinic AcetylcholineReceptor,nAChR)、神经细胞黏附分子(Neural Cell Adhesion Molecule,NCAM)、低亲合力神经营养因子p75受体(p75 Neurotrophin Recepter,p75NT R)可能是介导RV感染机体的细胞表面受体[4]。细胞表面受体的浓度和亲合力的变化影响RV的感染。

nAChR是最先被确定的与RV感染有关的受体。nAChR位于神经-肌肉接头突触后膜,并不是病毒最初进入运动神经元的受体,其主要作用是使RV富集在神经-肌肉接头处,以更有效的感染运动神经元[5]。RV敏感动物,如红狐,其肌肉中nAChR的浓度远高于对RV不敏感的负鼠,但这两种动物的细胞受体对病毒的亲和力差别不大。在体外培养时,nAChR颉颃剂可降低 RV在细胞上的增殖滴度,但不能完全抑制RV对该细胞的感染[6]。

研究证实正常不感染RV的细胞株在表达NCAM后可感染 RV,经NCAM特异性抗体和NCAM的配体处理后病毒感染量减少。NCAM基因缺失的小鼠感染病毒后虽然发病延迟,但仍然易感,表明此受体虽然并非病毒感染的必须受体,但在感染过程中有作用[7]。

p75NT R受体介导RV感染机体的功能尚不明确。与NCAM类似,不感染RV的细胞株在表达p75NT R后可感染RV,但p75NT R缺失鼠和野生鼠的疾病级数并无区别。此外,在体外只有25%表达p75NTR的初级背根神经节可感染 RV,表明p75NT R可能只是RV结合其他细胞表面分子的基础[8]。碳水化合物、神经节糖苷、类脂也可能参与RV侵入,但功能尚不确定。

2 RV结构蛋白影响其致病性

RV的结构蛋白由糖蛋白G、核蛋白N、基质蛋白M、磷蛋白P和聚合酶蛋白L构成。

G蛋白在囊膜上构成病毒刺突,是 RV的表面蛋白,可结合细胞受体,介导病毒侵入,决定病毒的致病性和组织嗜性。研究表明,G蛋白上第333位精氨酸发生突变后,严重降低了RV对神经系统的侵袭力[9],G蛋白胞浆端的正确结构及其完整性介导RV与胞浆膜上受体结合及以pH值依赖的方式内吞。高水平表达RV G蛋白的重组狂犬病病毒,可加速被感染细胞发生凋亡,并激发机体的免疫应答,导致该重组病毒经外周接种时致病性降低[10]。此外,G蛋白与RV强、弱毒株诱导凋亡的机制有关。弱毒株的G蛋白比强毒株的G蛋白不仅能更有效地诱导被感染细胞发生依赖Caspase凋亡,而且还可激发由凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)参与的非依赖Caspase的凋亡,但后者可被Bcl-2的过量表达所阻断[11]。神经致病性 RV可能通过病毒G基因低水平表达及干扰促凋亡因子的激发,减弱对被感染神经元的破坏,有利于RV在神经元中的增殖及扩散,而缺失G蛋白的重组狂犬病病毒不能在神经元间扩散。Préhaud C等[12]发现G蛋白胞浆区PDZ结合位点(PDZ-BS)的单一氨基酸改变可引起感染的神经元发生凋亡,并使胞浆区G蛋白与PDZ结合的细胞互作因子相互作用,尤其是酪氨酸磷酸酶PT PN4。敲除PTPN4,病毒介导的凋亡作用消失。因此,推断 RV毒力的衰减需要宿主PDZ蛋白与G蛋白相互作用。

N蛋白基因序列相对恒定,点突变较少,是病毒中最稳定的蛋白。N蛋白是一个磷酸化蛋白,C端Ser389为磷酸化位点,N蛋白的磷酸化能调节病毒的转录和复制。N蛋白与RV基因组RNA结合,形成核糖核蛋白复合体RNP,保护病毒RNA免遭核酸酶破坏[13]。

P蛋白含多个磷酸化位点,富含Thr和Ser残基。P蛋白主要作为辅助因子,通过与L蛋白相互作用构成具有活性的RNA聚合酶,并具有调节病毒RNA的复制和病毒包装的功能。有研究表明,P蛋白通过与细胞动力蛋白轻链8(dynein light chain 8,LD8)相互作用,促进病毒RNA转录[14]。P蛋白对RV致病性的影响表现为:①LC8为动力轻链蛋白,在P蛋白上缺失LC8结合区的重组病毒,尽管不能阻止RV侵入神经,但影响该病毒的早期转录和复制;②RV感染细胞后,诱导细胞产生干扰素,干扰素抑制病毒的复制,但P蛋白可以影响干扰素的信号传导通路,从而抑制干扰素的作用[15]。

M蛋白在病毒颗粒中发挥着连接病毒囊膜和核衣壳的作用,可以调控病毒RNA的复制及病毒的组装,在病毒装配和出芽过程中起关键作用。减少M蛋白的表达或增加M蛋白的异源性表达均能导致病毒的转录水平增加[16]。

L蛋白是一种多功能蛋白,负责病毒基因组复制、转录及转录后的加工,包括起始转录、延伸、甲基化、加帽和polyA的形成。

3 RV感染导致神经元结构及基因表达水平改变

3.1 RV引起神经元的病理变化

RV强毒株感染在发病早期导致神经元功能异常,RV强毒株在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中几乎不引起神经元的凋亡和明显的病理变化,但在发病晚期被感染动物表现出明显的神经症状。鉴于RV致神经功能异常机制的复杂性,Scott C A等[17]应用RV感染表达荧光蛋白的转基因小鼠,对濒死期脑组织银染发现,在大脑皮质第V层椎体细胞的树突和轴突、小脑苔状纤维及脑干轴突出现串珠和断裂,在大脑皮质和海马椎体神经元的核周和近端树突,可观察到由肿胀的线粒体形成的空泡。在濒死期之前,当小鼠发生后肢麻痹时,串珠出现在小脑联合的少数轴突,推断这些变化可能是造成小鼠死亡和出现神经症状的原因。

3.2 感染RV导致功能相关的部分蛋白及基因的表达水平发生改变

FUIF等[18]研究了野生型RV感染小鼠的蛋白组变化,发现 Na+/K+ATPase和 H+ATPase上调,而 Ca2+ATPase及 α-SNAP、突触融合蛋白-18和pallidin等涉及突触小泡与突触前膜锚定和融合相关的蛋白下调,并在突触前膜观察到大量突触小泡聚集,推断可能是这些变化导致了神经功能异常。Ü bol S等[19]应用犬RV野毒株感染鼠,利用基因芯片从濒死期脑组织中筛选到98个表达差异基因,这些基因涉及免疫、代谢、受体和传输、生长因子、死亡介导因子、转录和翻译因子、蛋白酶及激酶等8类,而且发病期上调基因的数量较无症状期明显增多,推断是由于RV和细胞相互作用导致细胞内环境的严重破坏,造成神经功能障碍。

4 RV在神经核的分布影响神经通路的正常功能

按信息传导方向将神经传导通路可分为上行通路、下行性通路和环形通路等3种。上行性神经通路为感觉神经通路,下行性神经通路为运动通路,环形通路调控随意运动、情绪及运动发生后的及时中止等。Kelly R M等[20]将CVS接种于悬猴的前臂,免疫组化显示该病毒从注射部位扩散到丘脑的一级神经元,然后进入位于小脑半球髓质深部齿状核的二级神经元,最后从齿状核进入小脑皮质的蒲氏细胞(三级神经元),该感染过程指示了一条RV感染小脑的通路及三级神经元间的联系。将CVS分别接种到猴近前肢,远前肢、后肢和口颌面部,通过检测纹状体和下丘脑核中的RV,证实由背壳核和下丘脑核参与的皮质-基底核运动通路可形成独立的闭合环路,并在海马中出现大量的嗜酸性包涵体。Carrieri M L等[21]研究发现,应用 RV通过外周感染海马时,脑干和颈髓组织中抗原量远高于海马、大脑皮质和小脑皮质,因此研究RV在感染脑组织中的分布以及所涉及的神经通路及神经元结构和功能的变化,可能是揭示RV导致神经功能异常机制的有效手段。

5 RV可破坏血脑屏障

血脑屏障可以阻挡病原微生物和其他大分子物质在外周和神经组织之间的流动。Preuss M A R等[22]发现蝙蝠相关RV可通过侵入下丘脑神经纤维经血液进入大脑。在 RV感染病例,血脑屏障被破坏,中和抗体和其他免疫因子才能进入中枢神经系统以清除感染组织中的病毒。血脑屏障完整性被破坏与神经组织中出现淋巴细胞和抗体以及炎性物质有关系。Pleydell D R等[23]认为血脑屏障完整性的破坏是机体对抗嗜神经病毒感染主要的保护性机制。

6 RV不同毒株侵染部位复制特性不同

人感染RV街毒潜伏期为20 d～90 d,很少短于几天或多于1年[24],巨噬细胞可能起隔绝病毒的作用,致使潜伏期相对较长[25]。应用来源于花纹臭鼬唾液腺的街毒株通过肌肉接种9只臭鼬,在临床症状出现之前,其中4只于接种部位的外展肌纤维和个别肌细胞中,RT-PCR和免疫组化均呈阳性,但接种62 d～64 d后的脊神经或脊索呈阴性,说明RV在接种部位的肌组织中发生了复制,但还不清楚感染的肌纤维是否是RV侵入外周神经的关键;在小鼠模型中,应用RV街毒株肌肉接种,未检测到肌肉或其他神经外组织的早期感染[26]。CVS给成年鼠肌肉接种,接种后6 h～30 h间未在咬肌中发现病毒特异性RNA,但在接种后第18 h和第24天分别在三叉神经节和脑干中检测到RV基因组[27],提示RV没有在神经外组织复制即直接侵入神经。RV是否在所有感染动物的外周组织中复制及其复制是否是RV侵染外周神经的关键尚不确定。

7 结语

狂犬病是人畜共患的急性传染病,全世界有100多个国家受狂犬病危害,每年约有55 000人死于狂犬病,病死率极高,全世界仅有数例存活的报告。尽管已经对狂犬病进行了广泛的临床和病理学研究,但其潜在的致病机理尚不确定。病毒复制、分布及在体内的扩散途径等,这些都和发病机理相关。除了这些机制,狂犬病常出现的特有症状如不眠症、狂躁、吞咽困难、恐水等症状与RV感染对神经元结构和功能的影响之间的关系,是揭示RV致病的关键机制,RV侵染外周神经,进一步破坏血脑屏障的完整性,进入CNS侵染神经,分布于不同的神经核,影响神经元结构及某些神经通路的正常功能,导致部分蛋白及基因的表达水平、细胞表面受体浓度等发生改变,推断这些变化是造成RV神经症状的可能因素。对RV感染导致神经功能异常机制的理解不仅可加深对该病的认识,而且可为临床干预提供重要依据。

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Progress on the Pathogenesis of Neuronal Dysfunction Due to Rabies Virus Infection

SHAN Jing-hui,GUAN Zhen-hong,DUAN Ming,ZHANG Mao-lin*

(Key laboratory of Zoonosis,Ministry of Education,Institute of Zoonosis,College of Animal Science and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,J ilin130062,China)

Rabies is a highly contagious lethal zoonosis caused by rabies virus,which is characterized as the neurotropic infection.Many works had focused on it,however,its pathogenesis remains unclear.G protein of rabies virus(Rabies Virus,RV)interacting with nerve cell surface receptors to determine their neurotropic specific binding characteristics,other structural proteins of RV play an important role in protecting and regulating of RV,RV could significantly change the neuronal structures and the expression levels of some proteins and genes that are associated with function,and the distribution of RV in the nucleus may affect the normal function of neuronal pathways,all of those might determine clinical symptoms and deaths.This issue reviews the progresses in RV pathogenesis,hope to provide some light on neuronal dysfunction.

Rabies virus;neurological dysfunction;pathogenesis

S852.659.1

A

1007-5038(2011)08-0066-04

2010-12-14

国家自然科学基金项目(31072147);吉林省科技发展计划重点项目(20100954;20080930);国家科技支撑(2008BAB96B11-3)

单晶辉(1987-),女,硕士研究生,主要从事抗病毒性免疫子研究。