甲型H1N1流感病毒致病机理研究进展*

朱广蕊,潘耀谦,夏银可,刘兴友

(河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003)

甲型H1N1流感病毒致病机理研究进展*

朱广蕊,潘耀谦,夏银可,刘兴友*

(河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003)

本世纪首次暴发的甲型H1N1流感大流行,严重威胁了人和动物的健康,是其继1918年对全球进行疯狂肆虐之后的又一次严重打击。甲型H1N1流感病毒的主要蛋白结构包括血凝素蛋白(HA)、神经氨酸酶蛋白(NA)、聚合酶复合体(PB1、PB2和PA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1、M2)及非结构蛋白(NS1、NS2)等。目前研究表明,与甲型H1N1流感病毒致病机理相关的蛋白主要有HA、NA、PB1、PB2、NP和NS1,其编码基因结构的变化可能会造成致病力的改变和新一轮的流感大流行。另外,细胞因子也参与了甲型H1N1流感病毒的致病过程。因此,搞清楚该病毒的致病机理就显得尤为重要,论文对其研究进展进行了综述。

甲型H1N1流感;病原学;分子结构;致病机理

*通讯作者

流感病毒(Influenza virus,IV)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae),根据核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原性不同可分为甲型、乙型、丙型流感病毒属和托高土病毒属。在流感病毒的大家庭中,甲型流感病毒有着极强的变异性,感染范围最广、危害最大,常常导致世界性流感的大流行。例如,1918年在西班牙暴发的甲型H1N1流感曾导致全球约10亿人感染。2009年3月份,源于北美墨西哥的新甲型H1N1流感大流行向全球迅速扩散,最终演变为继1918年之后新世纪的首次流感大流行,其病情之重,波及范围之广,引起世人震惊。2010年10月,世界卫生组织发布报告[1],称严重威胁人类生命健康的甲型H1N1流感病毒已经在澳大利亚发生变异。

因此,进一步弄清楚该病毒的致病机理是非常重要的。本文在查阅大量文献的基础上,对甲型H1N1流感病毒致病机理的研究进展进行了综述,旨在对本病毒的致病性有更深刻的了解,为临床上本病的防治提供参考。

1 病原学

甲型流感病毒(Influenza virus,IV)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒属(Inf luenza virus A),是一种有包膜、单股负链、分节段RNA病毒。成熟的病毒粒子多数呈球状,直径在80 nm～120 nm之间。病毒的基因组大小约为13.6 kb,与蛋白质结合形成螺旋状对称的,直径约为 10 nm,包括 8个独立片段(片段 1、2、3、…、8),编码 2类蛋白,即结构蛋白(PB2、PB1、PA 、HA 、NP、NA 、M1、M2)和非结构蛋白(NS1、NS2)。结构蛋白HA和NA为糖基化结构蛋白,而其他为非糖基化的结构蛋白。由于甲型流感病毒极强的毒株变异性,其病原的变异常常导致世界性流感的发生。

2009年暴发的新甲型 H1N1流感病毒就是一种新型变异病毒,其遗传特性和抗原性等方面都和在人群中流行多年的季节性H1N1流感病毒不同。进化分析研究表明其包含有禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段,8个片段来自不同分支的流感病毒,拥有亚洲猪流感病毒NA和M基因特征和北美三源基因重配猪 H1流感病毒PB2、PB1、PA 、HA 、NP和NS基因片段特征。据称,该病毒自2008年12月至2009年1月间在猪群中发现,当时未引起足够重视结果导致甲型流感在全球的大流行[2]。

2 甲型H1N1流感病毒的蛋白结构特征

甲型H1N1流感病毒的基因组共编码10种蛋白质(8个主要结构蛋白和2个非结构蛋白),不同的蛋白质在其编码基因进化的过程中会有不同程度的变异,了解其变异特点更有助于对其致病机理的研究。

2.1 甲型H1N1流感病毒的主要结构蛋白

2.1.1 血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白 是甲型H1N1流感病毒主要表面抗原之一,是基因表达产物中最大而典型的I型糖蛋白。HA蛋白由两部分组成,分别为HA1(326个氨基酸)和HA2(223个氨基酸),二者由精氨酸(Arg)连接。与HA2蛋白相比,HA1蛋白位于HA蛋白的球部,承受较大的免疫选择压力,因而更容易变异。早期研究表明,HA1蛋白上44个氨基酸是宿主免疫系统作用的靶点,其变异直接导致病毒的抗原漂移[3]。另有研究表明[4],所有禽HA1蛋白拥有保守的4个糖基化位点,新甲型H1N1流感病毒(2009)HA1蛋白上增加了一个糖基化位点(NTT),这与近年来古典猪H1N1和三源重配猪H1流感病毒完全一致。因此,新甲型H1N1流感病毒与季节性H1N1流感病毒相比有较大的糖基化进化空间[5]。研究发现,HA蛋白受体结合位点上的氨基酸在所有禽流感病毒中都是保守的,而在哺乳动物人和猪中适应后就发生了变化,具有宿主特异性[6],这可能成为新甲型H1N1流感病毒在人际间传播的重要分子基础。

2.1.2 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) 是甲型H1N1流感病毒的另一个主要表面抗原,也是一种构成病毒囊膜上的刺突成份,但数量比HA少。NA属于Ⅱ型糖蛋白,即N端在囊膜内而C端在囊膜外。NA蛋白全长469个氨基酸,包括3个功能区:从N端开始,是信号肽和膜锚定区,约30个氨基酸;随之为茎区,约50个氨基酸;从77位氨基酸起到C末端,是头区,既是酶的催化位点,也是抗原的表达位点。NA的成熟形式是具有催化活性的同源四聚体,在四聚体的每个亚单位球状头部的表面有15个极性氨基酸,包括9个酸性氨基酸和6个碱性氨基酸[7]。这些氨基酸在所有的甲型流感病毒NA蛋白中都是保守的,是发挥NA活性所必需的蛋白。2.1.3 核蛋白(Nucleoprotein,NP) 是构成甲型H1N1流感病毒核衣壳的主要蛋白成分,是一种单体磷酸化蛋白,也是决定宿主范围的特异性抗原。其分子质量约为60 ku,包括498个氨基酸残基,富含精氨酸(Arg),不同亚型毒株间的氨基酸序列很保守,被认为是流感病毒分子进化和分类的基础。Reid AH等[8]鉴定了核蛋白6个与宿主特异性有关的位点,分别为 16、33、100、136、283、313 位点。新甲型H1N1流感病毒NP基因来源于古典猪H1N1流感病毒,但是其313位点的氨基酸却由F(苯丙氨酸)突变为V(缬氨酸),这可能是病毒适应人体的过渡性突变所造成的。

2.1.4 基质蛋白(Matrix proteins,M) 包含两部分,即M1蛋白和M2蛋白。M1由252个氨基酸残基组成,是病毒囊膜的重要组成部分,同时也是病毒粒子中含量最多的蛋白质。该病毒无糖基化位点,除了作为结构蛋白外,还具有多种生物学功能,如调控病毒的转录、组装以及参与细胞核与胞浆间的物质转运。M2蛋白包括97个氨基酸,分为胞外区、跨膜区与胞浆区。它在胞外区的14、16、18和20等四个位点的氨基酸在不同种宿主中有明显的区别[9]。禽病毒一般是14G(甘氨酸)、16E(谷氨酸)、18K(赖氨酸)、20S(丝氨酸),而人流感病毒和古典猪H1流感病毒一般为 14E、16G、18R(精氨酸)、20N(天冬氨酸),新甲型H1N1流感病毒(2009)的这4个位点是 14E、16E、18R、20S,兼有禽类和哺乳动物的特点。因此,通过对甲型H1N1流行株M2蛋白胞外区的检测可以开展进一步的研究。另外,研究发现,甲型H1N1流感病毒拥有对金刚烷产生耐药性的基因特征(M2基因S31N),对流感药物奥塞米韦(Oseltamivir)和扎那米韦(Zanamivir)敏感[10]。

2.1.5 聚合酶(polymerase,P) 包含3种蛋白成分,分别为PB1、PB2和 PA。前两种是碱性蛋白,而PA为酸性蛋白。每个成熟的病毒粒子约有30～50套的聚合酶蛋白,但在病毒复制过程中,并不是这些酶全部参与了合成,而是对病毒基因表达和复制来说是必需的少量聚合酶才参与了合成[11]。聚合酶蛋白与vRNA和NP蛋白一起形成非共价键复合物,该聚合酶蛋白不直接启动RNA表达,而是借助宿主的mRNA作为启动子。只有在PB2识别帽状RNA后,才开始启动内部核酸酶的活动。PB1不仅负责cRNA和vRNA的合成,而且参与了新合成的mRNA链的延伸。PA功能还不确定,有研究称其可能有聚合酶活性,能够发挥激酶或者是解旋酶的作[12]。

2.2 甲型H1N1流感病毒的非结构蛋白

非结构蛋白(Nonstructural proteins,NS)由片段8编码。片段8有 2个ORF,可编码NS1蛋白和NS2蛋白,两者的分子质量分别为25 000 ku和12 000 ku。这两种蛋白质只在感染的细胞中存在,NS1主要在核内,NS2主要在胞浆内,而不存在于病毒粒子内。NS1分为2个功能区:氨基端的 RNA结合区和羧基端的“效应”区。NS1蛋白的长度不一,在不同的宿主和毒株间表现为一定的宿主特异性[13]。

3 甲型H1N1流感病毒的致病机理

病毒的致病能力是多个蛋白相互作用的结果。研究证明,参与甲型H1N1流感病毒的致病过程的主要蛋白有HA、NA、聚合酶复合体、NP和NS1。另外,细胞因子也在致病过程中发挥了重要作用。

3.1 血凝素(HA)

甲型H1N1流感病毒的 HA蛋白由HA1和HA2亚基组成,HA1主要介导与宿主细胞受体结合,HA2主要参与病毒和细胞融合的过程。只有前体HA蛋白在被裂解为以二硫键相连的亚单位HA1、HA2后,病毒才具有感染活性,以及发挥一系列的生物学活性。因为在病毒与细胞内体膜融合时需要HA2的N末端介导,这样才能使病毒的核糖核蛋白(RNP)释放入细胞质中。因此,HA蛋白是否被裂解为HA1和HA2,是病毒能否感染的必要条件[14]。介导甲型H1N1流感病毒HA基因在裂解位点处有1个碱性氨基酸-精氨酸(Arg),后者只能被特定的精氨酸特异酶(如胰蛋白酶等)所裂解和切割。而与之不同的是,某些高致病性禽流感病毒如H5N1和H7N7的HA基因裂解位点处有多个碱性氨基酸,可使HA蛋白在多种细胞内裂解。新甲型H1N1流感病毒的HA1蛋白的受体结合位点具有典型的北美古典猪H1N1病毒特性。尽管和古典猪H1N1流感病毒之间有着某些氨基酸的不同,但这些不同均不在受体结合位点。

3.2 神经氨酸酶(NA)

NA蛋白是甲型H1N1流感病毒双层类脂膜上的另一种表面糖蛋白,在流感病毒的复制过程中起重要作用。NA可识别位于细胞表面的病毒受体的唾液酸残基,并将其清除,从而有助于病毒进入细胞内。另外,它还可协助已复制完成的病毒颗粒的释放。据报道[15],NA基因的羧基端赖氨基残基(Lys453)能与血清中的纤维蛋白酶原连接,激活HA的裂解,从而使病毒与机体细胞发挥相互作用,而突变这个赖氨酸残基可以抑制HA的裂解。另外,NA的146位氨基酸的去糖基化会抑制这种由纤维蛋白酶原介导的HA裂解,而这种氨基酸的变化目前只在甲型H1N1流感病毒中被发现。在试验室条件下,由于HA和NA不匹配,因此很难获得稳定而高滴度的重组毒株。Matrosovichm M N等发现,在新的宿主体内,流感病毒改变HA受体结合特性的同时,NA序列也随之发生了改变。由此证明,HA蛋白与NA蛋白之间的平衡与流感病毒的致病性有关。研究认为[16],NA蛋白的非结构链接区(残基35～82)将神经氨酸酶催化部位(残基83～469)和包膜锚定区连接在一起,而这一非结构链接区对于转录后修订作用的发挥起重要作用。研究表明[17],新甲型H1N1流感病毒的NA基因中发现了8个小的成簇排列序列一致的糖基化位点(Nx[ST]),这些糖基化位点可能与NA蛋白的转录后修订位点有关。据结构模型推测,还发现一个新的糖基化位点N386,该位点位于NA蛋白的表面。

3.3 聚合酶复合体

甲型H1N1流感病毒聚合酶复合体有3个亚基,分别为PB2、PB1和病毒 PA。研究证明,PB2基因决定流感病毒的宿主范围。据研究,所有禽流感的PB2的627位氨基酸都是谷氨酸,而人流感病毒则为赖氨酸,因此,PB2的627位氨基酸在甲型流感病度宿主范围中起决定作用[18]。目前,所有的新甲型H1N1流感病毒分离株在PB2蛋白的627位点均为谷氨酸,这是禽流感病毒的特征。1918年流行的H1N1流感病毒和高致病性H5N1禽流感病毒的PB1-F2蛋白均与其高致病性有关[19],而新甲型H1N1流感病毒编码PB1-F2蛋白的基因在12位点处的终止密码子将其截短。这种变化表明,有可能存在一些还未被认识的分子决定因素,对新甲型H1N1流感病毒的致病力、复制能力有重要的影响。

3.4 核蛋白(NP)

NP蛋白是甲型H1N1流感病毒重要的结构蛋白,在病毒感染细胞过程中发挥多种功能。NP蛋白富含Arg,是一种单体磷酸化蛋白,能实现其他底物和自身的磷酸化[20]。在病毒粒子中,NP能与cRNA和 vRNA结合分别形成 cRNP和vRNP。NP蛋白上有亲核信号,向细胞核定向移动,与聚合酶蛋白一起发挥作用,介导脱衣壳后的vRNA的核内转移。NP蛋白在病毒从转录过程向核酸复制过程转换时起关键的作用,这一转换机制目前有3种假说:第一种,NP蛋白是一种抗终止因子,可解开vRNA模板上的茎环结构,从而使聚合酶复合体跨过多聚U结构,进而合成cRNA;第二种,NP蛋白可与新合成的cRNA和vRNA结合成复合物形式,这种结合起到抗终止作用,使聚合酶跨过多聚U结构产生cRNA;第三种,游离的NP蛋白直接作用于聚合酶复合体,使其从转录模式向复制模式转变。上述各种假说那一种更为合理,还有待进一步研究。

3.5 非结构蛋白NS1

甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白是一种RNA结合蛋白,也是病毒的一种非必需致病因子,通过拮抗干扰素及其诱导蛋白的抗病毒活性来减弱宿主的免疫应答,这种功能的发挥主要与它的双链 RNA结合区有关。另外,NS1蛋白还参与了病毒的复制周期,并在此过程起着重要的调节作用。研究发现[21],当猪感染了带有高致病性禽流感病毒H5N1的NS1基因的重组人流感H1N1病毒后,所产生的病毒血症、发烧以及体重下降等临床症状要比感染野生型人流感H1N1病毒更加典型,病程更长。

研究发现,NS1蛋白羧基端的4个氨基酸残基形成的PDZ结构域(由80 aa～90 aa组成的一种常见的蛋白结构)可能是决定流感病毒毒力的因素之一[22],参与机体信号转导过程中蛋白的相互识别。在动物试验中,1918年的甲型H1N1流感病毒及高致病H5N1病毒NS1基因重组体病毒,毒力增强。有关研究证实,和PB1-F2一样,新甲型H1N1流感病毒的NS1基因终止密码子缩短,从而导致在1918年H1N1流感病毒存在的PDZ结构的缺失。这些研究结果说明NS1基因与甲型H1N1流感病毒致病力可能有重要的关系。

3.6 细胞因子

人感染甲型H1N1流感病毒后,组织病理学观察显示支气管和细支气管上皮广泛变性、坏死,腔内充满有中性粒细胞、单核细胞等的渗出液[23]。动物研究表明,感染了甲型H1N1流感病毒的猪组织炎性细胞释放的酶和细胞因子如 IFN-α、TNF-α、IL-1和IL-6等,可导致气管阻塞、肺功能下降、高热、乏力等症状,且细胞因子间能相互增强彼此间的病理作用[24]。临床研究同样证实[25],呼吸道分泌物IL-6、IFN-α含量与血中IL-6浓度与流感症状的严重程度有关联。

4 小结与展望

由于甲型流感病毒的变异性极强,导致病毒蛋白结构的变化和致病力改变是造成该病毒大流行的最重要原因。因此,只有搞清楚了该病毒的致病机制,才能做到甲型H1N1流感的可防、可控、可治。虽然在2011年8月,世界卫生组织宣布甲型H1N1流感大流行结束,但这并不意味着甲型流感病毒已经彻底消失。

2010年10月23日世界卫生组织发布报告,称严重威胁人类生命健康的甲型H1N1流感病毒已经在澳大利亚发生变异。又据美国《病毒学杂志》的研究报告,称其发现了甲型H1N1流感病毒发生某种变异后更加致命的原因。通常人们呼吸道中的纤毛会不断摆动,将进入呼吸道的各种异物带到喉头,然后通过咳嗽排出体外。但如果纤毛细胞病毒感染,呼吸道的自我清洁机制减弱,病毒和细菌可以长驱直入,引发肺炎。研究者发现这种变异病毒侵入呼吸道纤毛细胞的能力更强,因此导致更高的死亡率。

因此,我们仍然需要继续保持警惕,继续监视这种病毒的新动向,关注其可能发生的变异和进一步演化。因此,对病毒的致病机理进行研究,就显得意义深远,还需要我们进一步的努力。

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Progress on Pathogenic Mechanism of Influenza A(H1N1)Virus

ZHU Guang-rui,PAN Yao-qian,XIA Yin-ke,LIU Xing-you

(College of Animal Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang,Henan,453003,China)

The first outbreak of pandemic influenza A(H1N1)this century has seriously threatened people and animals,health,also it is a hard hit to the world after its ravage in 1918.The main molecular structure of Influenza A(H1N1)virus include haemagglutinin(HA)protein,neuraminidase(NA)protein,polymerase complexes(PB1,PB2 and PA),nucleoprotein(NP),matrix protein(M1,M2)and nonstructural protein,etc.Some of these are have important relationship with the virus pathogenic mechanism,for example,HA,NA,PB1,PB2,NP and NS1.The structure evolution of genes which encoding them may cause irulence changes and a new round of pandemic influenza.In addition,cytokines also involved in this pathogenic process.Therefore,it is particularly important to understand the virus pathogenic mechanism and researchs progress on it are reviewed in this paper.

Influenza A(H1N1)virus;etiology;molecular structure;pathogenic mechanism

S852.659.5

A

1007-5038(2011)08-0070-05

2010-12-14

国家自然科学基金(30771601);河南省杰出人才创新基金(0521001800)

朱广蕊(1988-),女,河南南阳人,硕士研究生,主要从事动物传染病学与分子病原学研究。