GHRP对心衰大鼠心功能及细胞因子的影响

宋汉君 田国忠 韩 曦 扈清云 王培军 (佳木斯大学基础医学院解剖教研室,黑龙江 佳木斯 154007)

慢性心力衰竭(CHF)是一种复杂的临床综合征,是多种心血管疾病发展的严重阶段,且预后较差。研究表明,细胞因子的异常在 CHF的病理生理和发病机制中起重要作用〔1〕,其中内皮素-1(ET-1)在正常情况下含量较少,在 CHF发展过程中显著升高,且与 CHF程度密切相关,并且是 CHF独立的预后因素〔2〕。 21世纪国内外研究者提出 “心衰生物学治疗”〔3,4〕的观点。近年研究表明,生长激素释放肽(GHRP)对心脏有较全面的保护作用。本研究通过观测 CHF大鼠心功能、心肌细胞形态及 ET-1表达的变化,探讨 GHRP的治疗作用,以期为临床治疗 CHF提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康 Wistar大鼠 30只,由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂 盐酸阿霉素(ADR,浙江海正药业股份有限公司);GHRP-2(上海超研生物科技有限公司);ET-1免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 随机分为正常组、模型组和治疗组,每组 10只。模型组第 2、4天腹腔注射(ip)ADR 1 mg/kg,第 6、8天 ip ADR 2 mg/kg,第 10、12天 ip ADR 3mg/kg,第 14、16天ip ADR 4mg/kg,第 17天取材。正常组 ip等体积生理盐水;治疗组 ip ADR同模型组,同时从第 10天起,每日尾静脉注射 1次 GHRP-2 25μg/kg,第 20天取材。

1.2.2 心功能测定 ①动物称重后用戊巴比妥钠 ip麻醉;②气管插管,在大鼠颈部暴露颈部气管,将插管插入,并接小动物呼吸机;③颈外静脉插管,颈部游离颈外静脉,迅速向心导入插管,并通过导管注入肝素抗凝;④颈总动脉插管,在颈部分离颈总动脉,迅速向心导入插管,经换能器连接生理多导仪,描记相关血流动力学指标。

1.2.3 苏木素-伊红(HE)染色光镜观察 心功能测定完成后,打开胸腔,左心室插管,冲洗,迅速取出心脏,吸去血迹,将心脏切成厚约 4～5 mm的块状组织后,固定。经水洗、乙醇脱水和二甲苯透明后浸蜡,包埋,切片。二甲苯透明,乙醇脱水,水洗。染色后,经水洗、脱水、透明,中性树胶封固。在 400倍镜下观察心肌细胞形态变化。

1.2.4 免疫组织化学(IHC)法观测心肌中 ET-1免疫阳性细胞平均光密度 按说明书采用亲合素-生物素-酶复合物法(SABC)染色。使用 BI-2000医学图像分析系统检测、分析数据。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.0统计软件进行处理,数据均

2 结 果

2.1 心功能测定 各项心功能指标正常组均正常。模型组心率、动脉压、心脏舒张期左室内压最大变化速率均低于正常组,且差异显著(P＜0.05)。治疗组与正常组比较,左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dt-max)等均无显著差异。见表 1。

2.2 心肌 HE染色光镜观察 正常组心肌结构清晰,肌纤维连接紧密,排列整齐,细胞质丰富均匀;模型组心肌细胞有不同程度的炎性细胞浸润,受累较重的心肌细胞呈小灶状或片状坏死,肌纤维排列紊乱,细胞水肿,出现空泡样变;治疗组与正常组比较,心肌细胞变化不明显。见图 1。

2.3 心肌中 ET-1免疫阳性细胞平均光密度 各组心肌中ET-1表达的平均光密度,模型组(0.369±0.016)高于正常组(0.296±0.022)、治疗组(0.310±0.020),且差异显著(P＜0.05);而治疗组与正常组比较,差异不显著(P＞0.05)。

表1 各组大鼠心率、动脉压等变化(±s,n=10)

表1 各组大鼠心率、动脉压等变化(±s,n=10)

与正常组、治疗组比较:1)P＜0.05;下表同

组别 n 心率(次/min) 动脉压(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)正常组 10 247.3±19.28 132.1±17.43 3 224.4±278.07 2339.8±182.06模型组 10 212.6±12.851) 106.5±15.981) 2 142.2±252.091) 1 482.9±210.021)治疗组 10 220.3±14.94 121.4±10.91 3 084.7±275.96 2 152.1±242.35

图1 各组心肌HE染色结果(×400)

3 讨 论

近年来随着心血管疾病发病率的升高,CHF的出现也呈上升趋势。20世纪 90年代人们才逐渐认识到心肌重塑是心衰发生发展的基本机制,在这个过程中细胞因子起到重要作用。ET-1是主要由血管内皮细胞和心肌细胞等合成及分泌的一种活性多肽,具有正性肌力作用,通过激活原癌基因刺激生长,使心肌细胞肥大和增殖,心肌肥厚〔5〕。国内外研究显示,ET-1在正常人血浆中的含量较低,但在CHF患者血浆中含量显著升高〔6〕,与 CHF的严重程度密切相关〔7〕。 Margulies等〔8〕研究发现 CHF中 ET-1是一个敏感和特异的指标。因血浆中ET-1的来源较为广泛,所以本实验通过IHC法检测心肌中 ET-1免疫阳性细胞的变化。结果显示:心肌中 ET-1表达的平均光密度,模型组高于正常组、治疗组。由此可见,心肌组织中的ET-1与CHF密切相关,并且参与到 CHF的发生、发展过程中。由于血流动力学改变,造成血管内皮细胞受损,血管内皮功能障碍,血管壁切应力改变、缺血缺氧、交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活和多种细胞因子的激活而导致 ET-1释放增加。

本实验研究显示,治疗组与模型组比较,动脉压、心脏舒张期左室内压最大变化速率明显增加,与国内外的报道一致,说明 GHRP能够通过调节血流动力学来改善心功能。心肌中ET-1表达水平下降,可能的机制:①GHRP通过 RAAS,降低血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度,减少对心肌正常功能的损伤。②抑制 CHF大鼠应激激素的过度反应,降低ET-1的浓度。此外曹济民课题组研究发现,GHRP既能增加心脏收缩,又能增加心脏的舒张,在心脏血流动力学方面作用明显〔9〕。因而 GHRP能够调控ET-1对心脏的作用。

目前国内外GHRP对CHF心脏作用的研究甚少。通过本研究显示,GHRP能降低 ET-1的表达,改善心功能,以期为 CHF生物学治疗药物的研制和开发探索新思路,为临床上应用 GHRP相关药物治疗CHF提供理论依据。

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5 Ram CV.Possible therapeutic role of endothelin antagonists in cardiovascular disease〔J〕.Am J Therapeutics,2003;10(6):396-400.

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7 李铁志,张晓刚,潘丽丽,等 .血浆脑钠肽和内皮素 1在心力衰竭患者中的浓度变化及相关性〔J〕.中国医科大学学报,2008;37(1):105-6.

8 Margulies KB,Hildebrand FL Jr,Lerman A,et al.Increased endothelin in experimental heart failure〔J〕.Circulation,1990;82(6):2226-30.

9 Xu XB,Cao JM,Pang JJ,et al.The positive inotropic and calcium-mobilizing effects of growth hormone-releasing peptideson rat heart〔J〕.Endocrinology,2003;144(11):5050-7.