S100A4基因表达与胃癌生物学行为的关系

陶致侃 (沈阳医学院沈洲医院普外科,辽宁 沈阳 110002)

S100A 4是S100家族中研究最多的具有促肿瘤作用的蛋白,通过降低肿瘤细胞间黏附力、促进细胞外基质的降解和重塑、增加肿瘤细胞的运动能力、抑制细胞凋亡和促进细胞异常增殖、促进血管生成等途径,参与细胞的异常增殖、恶变、浸润转移等肿瘤发生、发展中不同阶段的病理过程,进而发挥其促肿瘤作用〔1〕。在多数肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺癌中,S100A4的表达均高于对应正常组织〔1,2〕。在此,本文采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测转移相关基因 S100A 4在胃癌病灶中的表达,探讨其表达水平与胃癌生物学行为和病情进展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集本院普外科 2006年 3月至 2009年 5月 45例原发性进展期胃癌切除标本。所有患者术前未经放疗或化疗,病灶均为单发。根据其组织学类型和分化程度,将高分化、中分化腺癌 15例归入分化型,低分化腺癌、黏液腺癌、未分化癌、印戒细胞癌等 30例归入未分化型〔3〕;浸润深度按固有肌层(mp)～浆膜下(ss)和穿透浆膜(se)～侵及周围脏器(si)分为两组;TNM分期参照 1997年 UICC第 5版分期标准〔4〕。

主要试剂:细胞总 RNA提取试剂 TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司),逆转录试剂盒 Reverse Transcription System A 3500、TaqDNA合成酶、PCR反应缓冲液(Romega公司),S100A 4及内对照 β-actin的PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 手术标本离体后,立即在肿瘤对侧剖开胃壁,在肿瘤生长良好,无坏死区域取瘤组织一块,另于标本距病灶最远处取黏膜组织作为对照。将组织盛于经高压灭菌的Eppendorf管中,置入 -80℃超低温冰箱保存。

1.2.2 细胞总 RNA的提取 取出保存的沉渣,按照 TRIzol试剂说明书进行细胞总 RNA提取。将提取的RNA溶于 10μl的无 RNA酶水中,于 -80℃冰箱保存。

1.2.3 RT-PCR检测 取 1μl RNA,参照逆转录试剂盒说明书的比例加样,进行逆转录反应。反应条件为:42℃,60 min;99℃,5 min;4℃,5 min。

以 cDNA为模板进行 RCR扩增。S100A 4引物序列:5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′和 5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′,产物 片 段 277 bp;内 对 照 β-actin引 物 序 列:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′和 5′-CTCCTTAATGTCACGCACG ATTTC-3′,产物片段 513 bp。 PCR反应条件为:变性:95℃,45 s;退火:57℃,45 s;延伸:72℃,1 min;共 30个循环。

取 PCR产物 10μl行 1.5%琼脂糖凝胶电泳,以自动成像仪摄下电泳图像;采用Gel-work-ID软件分析图像,计算目的基因表达的相对定量值。

1.3 统计学方法 淋巴结转移程度不同的各组间均数比较采用方差分析,其余各组间均数比较采用 t检验。数据处理使用SPSS10.0版软件。

2 结 果

2.1 S100A4 mRNA表达与胃癌临床病理因素的关系 45例病灶组织均检测到 S100A4 mRNA表达,黏膜组织表达者仅 28例,且表达水平远低于病灶。S100A 4 mRNA表达水平与胃癌的大体类型、浸润深度(P＜0.01)及淋巴结转移程度(P＜0.05)密切相关。见表 1。

2.2 S100A4 mRNA表达与胃癌 TNM分期的关系 TNMⅢ/Ⅳ期病灶 19例,其 S100A 4 mRNA表达水平(0.545 9±0.136 0)明显高于Ⅰ/Ⅱ期病灶(26例)的水平(0.677 8±0.148 1)(P＜0.01),即随着病期进展,S100A4表达水平明显增高。

表1 S100A 4 mRNA表达与胃癌临床病理因素的关系

3 讨 论

S100A 4又称 CAPL、p9ka、mts1等,是 1989年由 Sbralidze从高转移性小鼠乳癌细胞中克隆的一种转移相关基因,1992年克隆了人类 S100A 4基因。该基因位于染色体 1q21,全长2 837 bp,其编码产物为 101个氨基酸的蛋白质,属 Ca2+结合蛋白 S100家族的成员。近年来的研究表明,S100A4表达与多种恶性肿瘤的侵袭、转移能力呈正相关,被认为是反映肿瘤预后不良的分子标志物之一〔5～7〕。有学者将 S100A 4基因转染至大鼠良性乳腺上皮细胞或侵袭转移力较低的人乳癌细胞系MCF-7后,良性上皮获得了转移表型,癌细胞的侵袭转移能力则显著增强〔8,9〕;通过反义寡核苷酸、RNA干扰等方法抑制 S100A4表达,可明显降低高转移性肿瘤细胞的侵袭、转移率〔10～12〕。目前认为,S100A 4能增强基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性,下调其组织抑制因子 TIMPs的合成,从而促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解和肿瘤浸润;还能通过影响细胞骨架动力学,上调局部黏附分子表达,改变ECM结构等机制,增强瘤细胞的运动和黏附能力〔13〕。可见,S100A 4通过多种机制,在多阶段促进了肿瘤的侵袭和转移。

侵袭和转移是恶性肿瘤生物学行为的重要标志。就胃癌而言,其最常见的转移方式为淋巴转移,而浸润深度和大体类型分别反映了癌灶在胃壁内侵袭的深度和广度。本研究发现,S100A 4mRNA在 BorrmannⅢ/Ⅳ和侵入浆膜层(se～si)的胃癌病灶中呈现明显高表达,而且随着淋巴结转移程度的进展,表达水平也逐渐增高。此结果提示,S100A 4表达与胃癌的侵袭和转移行为密切相关,其高表达是癌灶高侵袭力的象征。

另一方面,肿瘤 TNM分期是国际公认的描述病情进展、判断病人预后的重要参照。本研究中,随着 TNM分期的进展,S100A 4的表达呈上升趋势;TNMⅢ/Ⅳ期病例的表达水平明显高于Ⅰ/Ⅱ期。可见,S100A 4 mRNA表达水平在一定程度上可以反映胃癌的病程进展和患者的预后情况。

综上所述,S100A4的高表达与胃癌的恶性行为和不良预后密切相关。以该基因为靶点的基因阻断治疗可能会产生良好的效果,有待于进一步的研究。

1 王晓红.肿瘤转移相关基因的研究进展〔J〕.医学综述,2008;14(21):3246-8.

2 黄海力,吴本俨,朱旭东,等.S100A4表达与胃癌生物学行为及预后的相关性研究〔J〕.解放军医学杂志,2008;33(5):506-9.

3 Japanese Gastric Cancer Association.Japanese classification of gastric carcinoma〔J〕.Gastric Cancer,1998;18(1):10-24.

4 Sobin LH,Fleming ID.TNM classification of malignant tumors,fifth edition〔J〕.Cancer,1997;80(12):1803-4.

5 Cui JF,Liu YK,Pan BS,et al.Differential proteomic analysis of human hepatocellular carcinoma cell line metastasis-associated proteins〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2004;130(5):615-22.

6 Missiaglia E,Blaveri E,Wang YH,et al.Analysis of gene expression in cancer cell lines identifiescandidate markers for pancreatic tumorigenesis and metastasis〔J〕.Int J Cancer,2004;112(1):100-12.

7 Herman R,Fasheh R,Calabrese C,et al.ERBB2 up-regulates S100A4 and several other prometastatic genes in medulloblastoma〔J〕.Cancer Res,2003;63(1):140-8.

8 Lloyd BH,Platt-Higgins A,Rudland PS,et al.Human S100A4(p9Ka)induces the metastatic phenotype upon benign tumor cells〔J〕.Oncogene,1998;17(5):465-73.

9 Grigorian M,Ambartsumian N,Lykkesfeldt AE,et al.Effect of mts1(S1004)expression on the progression of human breast cancer cells〔J〕.Int J Cancer,1996;67(12):831-41.

10 Mazzucchelli L.Protein S100A4:too long overlooked by pathologists〔J〕?Am J Pathol,2002;160(1):7-13.

11 Gao XN,Tang SQ,Zhang XF.S100A4 antisense oligodeoxynucleotide suppresses invasive potential of neuroblastoma cells〔J〕.JPediatr Surg,2005;40(6):648-52.

12 Kato C,Kojima T,Komaki M,et al.S100A4 inhibition by RNAiup-regulatesosteoblast related genes in periodontal ligament cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2005;326(1):147-53.

13 Helfman DM,Kim EJ,Lukanidin E,et al.The metastasisassociated protein S100A4:role in tumor progression and metastasis〔J〕.Br J Cancer,2005;92(106):1955-8.