ISSR标记在芋遗传多样性研究中的应用前景

董红霞，黄新芳，刘玉平，柯卫东

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

ISSR标记在芋遗传多样性研究中的应用前景

董红霞，黄新芳，刘玉平，柯卫东

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

ISSR是在SSR基础上发展起来的一种分子标记技术，兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点。对运用形态学和分子生物学手段研究芋的遗传多样性进展进行了综述，并对ISSR分子标记技术在芋种质资源遗传多样性和亲缘关系、种质资源鉴定和指纹图谱构建、基因定位和分子标记辅助选择等方面的应用前景做出了分析和展望。

芋；ISSR；分子标记；遗传多样性

芋 [Colocasia esculenta（L.）Schott]又名芋艿、芋头，是天南星科多年生草本植物，原产于中国、印度和马来半岛等热带沼泽地。芋作为一种具有地域特色的水生蔬菜，在全世界广泛栽培[1]，其球茎富含淀粉及蛋白质，不仅可作为蔬菜食用，而且在很多国家或地区还被作为主食。此外，芋也是酿制酒精的原料。芋耐运输和贮藏，能解决蔬菜周年均衡供应的问题，并可作为外贸出口商品。相对其他作物而言，芋的相关研究尤其品种资源、遗传进化方面研究一直未受到世界各国的重视。

1 芋遗传多样性研究现状

1.1 芋种质资源的形态学研究

我国作为芋的起源中心之一，拥有丰富的芋种质资源，但我国在芋种质资源方面的研究相对滞后，对芋种质资源遗传多样性研究较少。目前主要的研究多停留在芋形态学的观察，其中最为复杂和最有争议的为芋的分类问题。由于芋的品种资源丰富，表型性状相对比较复杂，任意一种表型特征都可以作为分类的依据，如叶柄的颜色、球茎芽色、球茎肉质颜色、叶尖、叶基、叶形、地下茎形态、开花及花序、熟性以及水旱适应性等，因此分类时所依据的形态特征不同，分类方法也不尽相同。吴征镒等[2]依据母芋与子芋的发达程度及子芋习性将芋分为多子芋、魁芋和多头芋3类；张志[3]将芋分为叶柄变种和球茎变种，其中球茎变种又划分为魁芋、多子芋和多头芋3种类型；张谷曼等[4]根据芋的分蘖习性、染色体数目及地理分布，将芋分为4类：魁芋类（2n=2x=28）、魁子兼用类（2n=3x=42）、多子芋类（2n= 3x=42）及多头芋[2n=2x（3x）=28（42）]；魏文麟等[5]又将芋分为叶用芋变种、花用芋变种和球茎变种3类，每个类型再根据叶柄和芋的颜色分为若干副型。由此可见，芋的分类存在容易混淆和方向模糊的问题。由于对芋的分类大多根据其形态特征，故反映不出研究材料本质上的差异。另外，分类标准不统一，分类手段的局限，导致分类结果不一致。部分品种来源不清，品种亲缘关系不明，同物异名及同名异物等现象十分普遍，不利于芋种质资源的研究和品种的选育和推广，也给种质资源的保存、评价、创新、利用带来极大的不便。

20世纪90年代后期发展起来的DNA指纹图谱（DNA fingerprinting）技术具有多态性丰富、分辨率高、稳定性强等优点，目前已成为一种非常重要的研究种质资源的技术手段。该技术可以用来对种质资源进行评估以及对品种真实性和纯度进行鉴定。因而深入利用现代生物技术，从DNA水平上进行芋种质资源的遗传多样性分类研究显得尤为重要。

1.2 国内外芋遗传多样性的分子生物学研究进展

20世纪末，国内外已开展关于芋资源的遗传多样性的分子标记研究。1991年Lebot等[6]就用同工酶对1个南亚的芋种质资源库和1个美拉尼西亚的芋种质资源库进行了分析，揭示了2种芋资源的进化历程可能不同。Irwin等[7]1998年利用RAPD分子标记对44份芋种芋资源进行了遗传多样性分析，将印度尼西亚的芋种质资源与夏威夷的芋种质资源区别开来，同时也把二倍体和三倍体芋资源区别开来。2003年，Kreike等[8]采用AFLP标记技术对东南亚地区和太平洋地区（包括越南、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾、巴布亚新几内亚和瓦努阿图）的255个芋种进行了遗传背景和多样性的分析，研究结果显示相同国家或地域的芋种质资源的遗传相似性较高。Kreike等发现255个材料可以分为2大类，一类是亚洲国家的芋种质资源，另一类是太平洋地区的芋种质资源，但是泰国地区的的芋种质资源却划入太平洋地区。2004年Quero-Garcia等[9]利用AFLP技术辅助分析了瓦努阿图的450个芋样本，与育种者常用的农艺性状分类方法的结果相比较，证实了分子标记分析技术是对芋种质进行分类并指导其育种工作行之有效的方法。而用SSR标记对芋进行分析却受SSR引物的开发和数量的限制。2007年Mace等[10，11]利用7对SSR引物对巴布亚新几内亚的859个芋种质资源进行聚类分析，并与其农艺性状分类法的结果相比较，以保护当地的芋种质资源。

相对于国外而言，国内在芋种质资源保存和芋种质资源遗传多样性方面的研究比较零散。据报道，福建农学院收集了177份芋种质资源，中国科学院昆明植物研究所收集了100余份云南芋种质材料，国家种质武汉水生蔬菜资源圃收集并保存了287份来自全国各地的芋种质资源[12]。陈文炳等[13]应用聚丙烯酞胺垂直凝胶电泳检测了177份中国芋种质资源的酯酶同工酶，结果表明，栽培芋可能由野生芋进化而来，栽培芋和野生芋也有可能由不同来源繁衍而来。沈镝等[14]对来自云南的28份芋种质资源进行了12种同工酶的分析比较，筛选出酯酶 （EST）、过氧化物酶 （POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等5种酶系；同时，沈镝等[15，16]还对其进行了AFLP和RAPD的分子标记研究，研究表明，大多数芋野生种可以与栽培种聚在不同的类群，而且多数野生种与栽培种关系较远，结果与国外分子标记的研究结果一致。但是也并非所有的野生种都能聚到一起，一些野生种混在栽培类群中，而与其他一些野生种关系较远，体现出个体差异。沈镝等的研究还表明，3种分析方法检测的多态率均达85%以上，其中以同工酶法最高，AFLP和RAPD法相差较小，检测的效率以AFLP法最高。由于AFLP和RAPD法直接对DNA序列进行比较，所以检测差异效率要明显高于同工酶法，尤其是AFLP分子标记法。龙雯虹等[17]也用RAPD分子标记对云南芋种质资源进行了研究，但其所用材料较少，仅为10份。陈丽平[18]也用RAPD分子标记对47份芋属材料和2份海芋属材料进行了遗传多样性分析，结果将这些材料分为海芋属和芋属，其中芋属分为6组：第1组为绿白芋类，第2组为紫芋类，第3组为魁芋类，第4组为红芽芋类，第5组为叶用芋类，第6组为花茎用芋类（包括云南红芋和湖北古夫芋的花、茎用芋类，属于芋类的高级进化类型），此结果与植物学性状分类法的结果相符合。这6组芋的亲缘关系为花茎用芋类与叶用芋类最近，然后与红芽芋类、魁芋类、紫芋类、绿白芋类的亲缘关系依次变远。目前，国内在对芋遗传多样性方面所做的工作涉及面较小，较为零散，研究者多利用单一的AFLP或RAPD分子标记来研究芋的遗传多样性，但由于AFLP的操作复杂和RAPD的不稳定性，导致芋遗传背景的分析受到局限，试验结果的科学性需要进一步验证。

2 ISSR标记在芋遗传多样性研究中的应用前景

ISSR（inter-simple sequence repeats）是Zetkiewicz等[19]于1994年提出的一种微卫星基础上的分子标记。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨。

ISSR分子标记技术兼具 SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的特点[20]，其重复性好、稳定性高、操作简单、多态性丰富、成本较低、DNA用量小、安全性较高。ISSR引物具有通用性，适用于任何物种，扩增谱带多为显性标记，呈Mendel式遗传[21]，因而它是一种非常有发展前景的分子标记技术。目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等生物学研究中。与依据形态性状的标记方法相比，ISSR分子标记能直接检测到DNA分子结构上的变异，反映出研究材料本质上的差异，是育种家们更易接受的经济、实用的技术，在物种遗传多样性研究中也具有更为科学和更加广阔的应用前景。

2.1 遗传多样性和亲缘关系分析

基因型不同的品种或亲缘关系不同的物种，其基因组内核苷酸序列存在差异，当使用同一ISSR引物对不同基因组进行体外扩增时，基因组上与引物互补的DNA片段（模板）的数目、位点不同，因而其扩增产物（DNA片段）的大小、数目也不同，即扩增产物表现出多态性。当使用一系列不同的ISSR引物扩增时，这种多态性更加丰富。这种扩增产物的多态性反映了被测材料的遗传多样性[22]。遗传多样性和亲缘关系分析是植物种质资源研究和评价的主要内容之一，它决定了这些种质在今后育种实践中有效利用的问题。ISSR分子标记技术凭借其多态性丰富等特点已经被广泛应用于植物种质资源遗传多样性和亲缘关系研究，如杨本超等[23]根据每个品种独特的指纹图谱，利用ISSR标记区分了24份具代表性的烤烟种质的遗传多样性；姚明哲等[24]利用ISSR引物分析了我国36个茶树无性系品种的遗传多样性和亲缘关系，20个ISSR引物共扩增出368条谱带，其中多态性谱带占99.7%，亲缘关系树状图在分子水平上显示了我国主要茶树无性系品种间的亲缘关系，为今后茶树育种时亲本的选配提供了理论依据。由此表明ISSR标记适于种质资源的遗传多样性研究和亲缘关系分析。

2.2 种质资源鉴定和指纹图谱构建

随着种子产业的市场化发展，准确、快速、简捷的种子质量检测技术和方法成为研究热点。传统的形态学性状鉴定法需要进行品种的田间性状调查，时间长、耗费高，难以用于新品种的区分。而ISSR分子标记技术以其稳定可靠、重复性好、多态性丰富、成本低和周期短等优点在种质资源收集和品种鉴定中越来越受到重视。利用ISSR分子标记绘制植物种质资源的DNA指纹图谱，作为其特征性状建立种质资源数据库，可用于种质鉴别[25]。

Kumar等[26]运用ISSR分子标记技术鉴定了4个因争议引发官司的辣椒（Capsicum annum）品种，被认为是首次运用可靠的DNA分子标记方法来维护植物育种者权利的有益尝试。Carvalho等[27]成功构建了5个杂交小麦F1代与其亲本的DNA指纹图谱，用以检测F1代的真实性和纯度。说明利用ISSR标记进行种质真实性的鉴定和遗传图谱的构建是可行且有效的。

2.3 基因定位和分子标记辅助选择

充分发掘和利用植物种质资源这一天然的优异基因库是育种工作者一直以来努力的方向。植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在。利用ISSR标记对某一特定DNA区域内的目的基因进行定位，进而获得目的基因，用于种间或种内目标基因的转移，也是分子标记应用于育种，创造新材料的重要手段。陈学好等[28]以黄瓜单性结实品系EP-6和非单性结实品系ZR-2为亲本构建群体，用65条ISSR引物进行PCR扩增，其中引物N92在亲本和DNA池之间扩增出1条大小为850 bp的多态性片段，对F2代群体135个单株验证，该片段稳定出现，在单性结实植株中表现为无带，在非单性结实植株中表现为有带，说明N92可以作为鉴别黄瓜单性结实与非单性结实的标记引物，为黄瓜单性结实基因的分子标记筛选和分子标记辅助育种奠定了基础。

3 展望

ISSR作为一种新型的分子标记技术，以其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点，在多种作物的种质资源研究尤其是在种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系及基因定位等方面已经得到较为广泛的应用。中国虽然拥有丰富的芋种质资源和古老的栽培历史，但在芋种质资源遗传多样性方面的研究还很不足，还未充分利用ISSR标记开展芋遗传多样性的研究。我们应积极借鉴ISSR分子标记在其他作物上成功应用的经验，加快芋遗传多样性研究的步伐，促使芋种质资源发挥更大的作用。

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Application Prospects of ISSR Molecular Marker on Genetic Diversity of Taro

DONG Hongxia,HUANG Xinfang,LIU Yuping,KE Weidong
(Wuhan Vegetable Research Institute,Wuhan 430065)

ISSR is a molecular marker technology developed on the basis of SSR marker with advantages of SSR,RAPD, RFLP,AFLP markers.Developments of studies on genetic diversity of taro were summarized.Application of ISSR marker on genetic diversity and relationship,identification and fingerprints construction,gene mapping and molecular marker-assisted selection of taro germplasms were also analyzed and prospected.

Taro;ISSR;Molecular marker;Genetic diversity

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.011

董红霞（1980-），女，博士，主要从事水生蔬菜品种资源研究，电话：027-88116313，E-mail：dhx1212@sohu.com

2011-07-11