乙型脑炎疫苗研究概况

栗永茂 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025)

曹胜波 (华中农业大学动物科技学院,湖北武汉430070)

王明蛟 (广州雨润肉类食品有限公司,广东广州51 0935)

霍雨艳,熊 涛,吴光旭 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025)

乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus,JEV)又称日本脑炎病毒,是一种有包膜的单股正链RNA病毒。由其引起的乙型脑炎主要在东南亚的一些地区和国家流行,其中我国是高发区。亚洲每年约有乙脑病例5万多人,其中约有万人被致死,因此流行性乙型脑炎是亚洲公共卫生的重要问题之一。同时,乙脑也是猪的重大疫病之一,其暴发常给养猪业带来巨大的经济损失。而目前对乙脑没有特效的治疗方法,所以用疫苗预防和控制该病的发生显得尤为重要。因此寻求高效、安全及新型的乙脑疫苗,已经成为近年来的研究热点。

1 JEV分子生物学特点

JEV的基因组长约11 kb,含单一的开放读码框,依次编码3种结构蛋白 (C、M和E)和7种非结构蛋白 (NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1]。

C蛋白与基因组RNA构成病毒的核衣壳,对病毒有一定保护作用。膜蛋白M与病毒的装配、成熟有关。Takegami等 (1982)对其生物学功能进行了研究,认为M蛋白参与病毒的感染过程,是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分,而且还能诱生具有轻度中和作用的抗体。E蛋白是与细胞膜受体相结合,与病毒的致病性、诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。该蛋白上相关位点的氨基酸变异,对乙脑病毒神经侵袭力及神经毒力有重要的影响。另外,E蛋白还是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白,由它形成表面抗原决定簇,具有一定的血凝活性和中和活性。它能刺激机体产生抗体,保护机体免受病毒攻击。因此,人们历来把研究重点放在E蛋白上,深入研究其高级结构和功能,这将为基础研究和临床应用以及新型疫苗研究提供分子水平的依据。

NS1:是一种分泌型糖蛋白,约含350个氨基酸残基,蛋白分子内存在二硫键。NS1常以二聚体形式出现,它可能参与早期的病毒复制以及病毒组装和释放,是主要的抗原成分之一。研究表明黄病毒NS1蛋白在基因和表型水平上具有异乎寻常的高度同源性,可以作为RT-PCR检测和亚单位疫苗研制的材料。NS2A、NS2B的分子质量分别为17 ku和13 ku,均为疏水性蛋白,同源性较低,可能与膜功能相关。NS3:分子质量64 ku,两端的氨基酸均为亲水性蛋白,是一个具有解旋酶和激酶特性的功能蛋白。NS4:分为NS4A和NS4B 2种蛋白,分子质量分别为28 ku和14 ku,均为疏水蛋白,其结构和功能还不是非常的清楚。NS5:分子质量为103 ku,在黄病毒中同源性最高,可能参与病毒RNA聚合酶的合成[1]。

2 原代地鼠肾细胞灭活疫苗

本疫苗的毒株为北京P3株,通过原代地鼠肾细胞培养制备,1968年在中国开始生产和使用。在非流行区免疫2针后的抗体转阳率为60%,在流行区免疫2针后抗体转阳率为57.23%,1年后加强免疫1针,抗体转阳率上升为95.95%[2]。根据我国不同流行区的调查,该疫苗的保护率在76%～94%[3]。但是该疫苗不仅存在杂蛋白较多、抗原含量较低、免疫持久性差等缺点,而且不良反应发生率较高。

3 原代地鼠肾细胞减毒疫苗

原代地鼠肾细胞减毒疫苗,是目前唯一用于人类的乙脑减毒活疫苗,并已写入WHO规程。它是我国俞永新等学者用具有良好免疫原性的减毒株SA14-14-2,通过原代地鼠肾细胞培养制备的活疫苗。与原代地鼠肾细胞灭活疫苗相比,乙脑减毒活疫苗能激发更强特异性的细胞免疫反应,血清中和抗体转阳率更高,持续时间更长[4]。该疫苗在非流行区注射1针以后,人体中和抗体转阳率为92.3%～100%,在流行区使抗体阴性儿童的抗体转阳率达94.74%。1996年由宾夕法尼亚大学医学院和华西医科大学联合在成都对该疫苗效果调查的结果显示,接种1针的保护率为80%,2针为97.5%。关于疫苗的安全性,根据疫苗研制过程对58万名儿童的观察,以及目前每年约5 000万人的疫苗接种,未见严重异常反应。由华西医科大学、宾夕法尼亚大学医学院、美国疾病控制中心等,对成都13 266名1～2岁儿童进行疫苗接种的观察,证实SA14-14-2活疫苗的安全性良好。原代地鼠肾细胞减毒疫苗从1989年开始生产,已累计使用约2亿人次,证实其具有不良反应少、免疫原性强、注射针次少等优点。现主要大规模应用于中国大陆地区,也已出口韩国和其他一些国家。

4 鼠脑灭活疫苗

该疫苗是目前得到国际广泛承认和使用的JE疫苗之一,也在美国获得批准上市使用。鼠脑灭活疫苗于1954年在日本首次获准,然后在20世纪60年代和80年代进行改进。类似的疫苗在亚洲几个国家生产是用Nakayama或者北京-1株,美国是用Nakayama-NIH株。鼠脑灭活疫苗在几个乙脑流行的国家能够有效地控制疾病,比如在日本、韩国、台湾和泰国等。

对于来自无传染源国家的人群,建议在第0、7、30 d分别接种鼠脑灭活疫苗3针。对于乙脑流行国家的儿童通常接种2针的鼠脑灭活疫苗,时间间隔1～4周,并且在一年后加强1针[5]。在亚洲地区人体免疫接种2针后血清中和抗体转阳率在85%以上,接种3针达88%～100%。当然只接种1针鼠脑灭活苗基本上是无效的。

少数研究评估了在初始免疫或者加强免疫后保护的持久性。在接受3针免疫的美国军事人员中,在免疫后2年和3年间,分别有100%和94%的人含有保护性中和抗体[6]。在日本无乙脑感染地区的研究显示,92%的受试者在加强免疫后2年仍有保护性抗体[7]。在日本乙脑低流行地区的一项研究显示,17名随机儿童,有82%的人在加强免疫后5年仍有保护性抗体,并且有53%的人在加强免疫后仍然能保护10年[8]。

鼠脑灭活疫苗相对安全,但仍对接种的儿童和成人存在一定的不良反应。局部红斑、疼痛、注射部位肿胀在接种者中出现率高达23%,而发热、头疼和头晕等现象在接种者中出现率高达13%[9]。也出现过严重但很少见的过敏和神经系统的不良反应,包括全身荨麻疹和四肢、面部和口咽血管性水肿,在一些病人中还伴随着支气管痉挛、呼吸困难和低血压。此外,和接种乙脑疫苗有关的严重或者致命的急性传染脑脊髓炎 (脑脊髓炎)病例以前在日本和韩国也报道过。为了应对这些情况,在2005年,日本暂停了鼠脑灭活疫苗的常规接种。在审查是否继续使用该疫苗的决定时,世界卫生组织全球疫苗安全咨询委员会认为,虽然没有证据证明脑脊髓炎与鼠脑灭活疫苗有关系,但是该委员会建议,鼠脑灭活疫苗应逐渐被新一代乙脑疫苗代替[10,11]。

5 Vero细胞灭活疫苗

Vero细胞灭活疫苗是乙脑SA14-14-2株在Vero细胞上培养制备的。成品不包含明胶稳定剂、抗生素或硫柳汞。2009年3月在美国批准对17岁及以上人群使用。由于Vero细胞灭活疫苗是17岁及以上人群使用的,所以鼠脑灭活疫苗仍然是唯一的儿童使用疫苗。为了满足儿童疫苗的使用,赛诺菲巴斯德已经预留了部分鼠脑灭活疫苗。

对Vero细胞灭活疫苗的免疫学研究没有很有效的数据。该疫苗能够获得美国批准是因为它能够诱导具有保护性的乙脑中和抗体和大约5 000人的安全性评价。非劣性免疫原性的研究比较了对18岁及以上人群在第0 d和28 d接种2针Vero细胞灭活疫苗和在第0、7、28 d接种3针鼠脑灭活疫苗。研究表明,96%接种Vero细胞灭活疫苗的受试者PRNT50≥10,接种鼠脑灭活疫苗的则为94%。Vero细胞灭活疫苗受试者的中和抗体平均滴度为244,鼠脑灭活疫苗的则为102。但是,Vero细胞灭活疫苗的中和抗体分析是用乙脑SA14-14-2株,而鼠脑灭活疫苗是用乙脑Nakayama株[12]。

Schuller等[13]评价了对已有蜱传脑炎病毒抗体的受试者接种Vero细胞灭活疫苗后的反应,结果表明蜱传脑炎病毒抗体在第一针注射时能增加对Vero细胞灭活疫苗的应答,而第二针就没有影响了。在第一针注射Vero细胞灭活疫苗后,在有蜱传脑炎病毒IgG下有77%的受试者产生了乙脑抗体,而没有蜱传脑炎病毒抗体的只有49%的受试者有抗体。但是,在第二针免疫Vero细胞灭活疫苗后,有和没有蜱传脑炎病毒抗体的受试者基本都会产生JEV抗体,分别为96%和91%。中和抗体滴度在第二针免疫后也基本上一样,分别为207和187。

在中欧的一项研究评价了Vero细胞灭活疫苗中和抗体的持续时间,在免疫两针的受试者中,有95%的人在第一次免疫后6个月仍有抗体,83%的人在第一次免疫后12个月仍有抗体[14]。然而,同样的研究在西欧和北欧,两次免疫Vero细胞灭活疫苗的人群,只有83%的人在第一次免疫6个月后有抗体,并且在第一次免疫后12 h和24 h血清保护率也分别下降到58%和48%[15]。

一项临床试验对同时接种Vero细胞灭活乙脑疫苗与甲肝疫苗进行了研究,结果表明二者相互没有影响[16]。在58例同时接种Vero细胞灭活乙脑疫苗和甲肝疫苗的受试者中,全部都产生了乙脑的中和抗体,而只接种Vero细胞灭活疫苗的仍有98%的产生了抗体。中和抗体滴度也基本上一样,分别为203和192。另外同时接种Vero细胞灭活乙脑疫苗和甲肝疫苗的都会100%产生甲肝抗体,而只接种甲肝疫苗的仅有96%产生抗体。但是,获得的抗体在男女之间是却存在差异,并且血清转阳和抗体滴度依赖于所用到的甲肝抗体。这些数据对临床有没有意义目前还不清楚。

在印度,研究人员对1岁和2岁的儿童使用标准剂量 (6 μ g)或者半剂量 (3 μ g)接种Vero细胞灭活疫苗的安全性和免疫原性进行了研究[17]。2组儿童隔28 d接种2针。第三组儿童接种3针乙脑鼠脑灭活疫苗 (JenceVac)分别在第0、7、28 d。JenceVac由the Korean Green Cross Vaccine Corporation生产,并且是没有在美国获得批准的。在28 d接种完全以后,6 μ g Vero细胞灭活疫苗接种组、3 μ g Vero细胞灭活疫苗接种组和鼠脑灭活疫苗接种组,血清转阳率分别为95%、96%和91%,中和抗体滴度分别为218、201、230。在血清转阳率和中和抗体滴度没有差异无统计学意义。进一步的儿童临床试验正在计划之中。

由Vero细胞灭活疫苗引起的局部和全身不良反应报告和鼠脑灭活疫苗或者单独使用安慰剂佐剂的类似。在参与临床实验的受试者中没有严重的过敏反应和神经副作用。但是,Vero细胞灭活疫苗的研究少于5 000名成年人,所以也不排除有严重不良反应的可能性。在非劣性免疫原性实验中,接种Vero细胞灭活疫苗出现不良反应的频率和接种鼠脑灭活疫苗类似[12]。约有≤1%接种Vero细胞灭活疫苗的人出现红斑、肿胀、注射部位疼痛等症状。全身的不良反应一般是轻微的,最常见的不良反应事件是每次接种后7 d内出现头痛 (26%)、肌痛 (21%)、流感 (13%)和疲劳 (13%)。

6 其他疫苗

随着生物技术的不断发展,人们努力寻找着既安全有效又价廉易得的新型JE疫苗。新型的乙脑疫苗主要包括嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白质疫苗和亚单位疫苗等。虽然这些基因工程类疫苗有着很大的潜力和应用前景,但还需要相关研究人员更多的努力才可能服务于人类。

7 结语

原代地鼠肾细胞灭活疫苗和原代地鼠肾细胞减毒疫苗主要是在我国使用,并且后者使用较多。但是由于存在地鼠肾细胞基质认证、批准等问题,原代地鼠肾细胞减毒疫苗尚未在国际上大规模使用。鼠脑灭活疫苗由于存在较多的不良反应,目前在一些地方和国家已经停止接种和生产。刚通过美国认证的Vero细胞灭活疫苗,将会为更多的人带来方便。相信随着生物技术的迅猛发展及人们认识的深入,人们终将会研究出更为安全、高效、价廉的乙型脑炎疫苗。

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