绿原酸提取分离及检测研究进展

周 舟 (湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙41 01 28)

彭 淼 (湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙41 01 28)

钟晓红 (湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙41 01 28)

绿原酸作为一种具有多种生物活性的天然物质,已引起国内外学者广泛关注,其提取纯化及检测技术的研发已成为当前日益关注的焦点。以前多采用单一的某种方法来提取绿原酸,目前则以多种方法相结合。张凌裳等[1]用酶解和超声相结合的方法,对绿原酸的提取工艺条件进行了优选。

在天然产物化学中,绿原酸类化合物属于发现早、分类广的一类化合物,它们具有分布广、活性强的特点。由于具有抗氧化、抗病毒和抑制6-磷酸葡萄糖转移酶等功效,因此绿原酸类化合物不仅可以作为药物,也是食品和饮料中重要的药补成分。另外,作为酚型抗氧化剂,它还有望成为良好的天然食品添加剂[2]。目前,随着绿原酸的生物活性越来越受到人们的重视,对它们的应用已经逐渐深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[3]。它是许多中药材的有效成分之一,又是某些中成药的质量指标,并且在日用化工、食品等领域都有广泛的应用。绿原酸主要存在于忍冬科忍冬属 (Lonicera)、菊科篙属 (Artemisia)植物中[4],主要包括杜仲、金银花、白日葵、咖啡、可可树。另外,水果中有苹果、梨,蔬菜中有马铃薯,以及大豆、小麦、绿茶等日常食用品中都含有微量的绿原酸类物质[5]。为了给绿原酸提纯和检测的深入研究以及应用提供参考,笔者从绿原酸的提取、分离纯化、检测等方面的研究进展作综述。

1 绿原酸的提取方法

目前绿原酸的提取方法主要有溶剂提取法、超声波提取法、超临界CO2萃取法和酶提取法等。在工艺化生产上则是以多种方法相结合为主[6]。

1.1 溶剂提取法

在溶剂提取法中,根据提取溶剂的不同可分为水提法与有机溶剂提取法。绿原酸为极性有机酸酯,在提取过程中,可能通过水解和相继分子内酯基迁移而发生异构化[7]。因而用水作溶剂时,会出现绿原酸含量降低,从而导致绿原酸得率下降。而在用有机溶剂提取时,综合各方面原因,一般采用乙醇提取,并且在醇溶液中,酶的催化分解作用会受到抑制,使得绿原酸稳定性增强。

(1)水提法 王茜等[8]探讨了水以及不同浓度乙醇、甲醇和丙酮水溶液作为提取溶剂对杜仲叶中绿原酸得率的影响,最终确定水作为绿原酸提取溶剂。水提杜仲叶绿原酸的最佳工艺条件为:提取温度60℃,料液比1∶16,pH 4,提取时间3 h。

(2)有机溶剂提取法 左航等[9]通过单因素试验和正交试验优化了杜仲叶中绿原酸的提取条件,由试验结果可知,杜仲叶中绿原酸提取的最佳工艺组合为:提取温度90℃,乙醇水溶液体积分数为70%,料液比1∶16,提取1.5 h。由极差分析可得,提取时间的影响最大,其次是料液比,提取剂中乙醇的含量,提取温度的影响最小。

1.2 物理因素提取法

在物理因素提取法中,有超声辅助提取法、微波辅助提取法、超高压提取法等提取方法。这主要是利用超声、微波、高压等物理因素所具有的机械效应、空化效应、生物效应、热效应来有效的提高活性物质的提取效率和得率。

(1)超声提取法 周军等[10]用超声波法提取金银花中的绿原酸,并与传统的水提、醇提工艺进行了比较,采用薄层层析法定性检验,紫外分光光度法测定绿原酸的含量。结果表明,超声波法的提取率高于传统溶剂提取法。在pH为4的70%乙醇中预浸泡24 h,料液比为1∶10,再用超声波提取4次,每次30 min,绿原酸收率最高含量可达9.58%。

(2)微波辅助提取法 童玲等[11]分别用微波辅助提取、超声辅助提取、冷凝回流提取、室温冷浸提取4种方法提取杜仲叶中的绿原酸,并将4种提取方法进行比较,结果显示提取率分别是21.07%、8.94%、7.23%、5.13%。可以看出微波辅助提取效率明显高于超声辅助提取法和传统提取法。微波辅助提取时的最佳条件是:乙醇体积分数60%、固液比1∶50、辐射时间2 min、微波压力2 atm。

(3)超高压技术提取法 田龙[12]对杜仲叶绿原酸的提取工艺方法进行了研究。建立了杜仲叶绿原酸超高压提取方法,以分光光度法为检测手段,以绿原酸的提取率为参数并将超高压提取法在提取时间、提取剂用量和提取率等方面与索氏回流和浸泡提取方法各方面进行了比较。最佳工艺条件为:溶剂为体积分数60%的乙醇,压力为400 MPa,杜仲叶粉末每克溶剂添加量为40 mL,温度为50℃。该条件下提取率为1.15%。

1.3 酶法提取

戴瑜等[13]研究了半纤维素酶法提取杜仲叶中的主要有效成分绿原酸,通过单因素试验、正交试验和方差分析确定了半纤维素酶法提取杜仲叶中绿原酸的最佳提取条件。即加入996 U/g半纤维素酶0.45%,提取pH为4.0,温度为40℃,得率最高可达38.01 mg/g。这种条件下半纤维素酶能发挥最大的催化效果,也能够较大地增加杜仲叶中绿原酸的得率。由于酶解的作用是使植物材料降解,使植物的有效成分更多的溶出,因此检测指标绿原酸得率的增加,标志着杜仲叶有效成分的得率也相应的增加。基于酶解提取法的操作简单、污染少、得率高等优点,使得酶解提取法在绿原酸的提取分离研究中将得到广泛的应用。

1.4 超临界CO2流体萃取法

超临界CO2流体萃取法作为一种将提取分离同时进行的萃取技术目前也广泛的被运用到绿原酸的提取分离中。谭伟等[14]对超临界CO2萃取葵粕绿原酸的影响因素 (夹带剂种类、浓度、用量、萃取温度、压力、时间以及CO2流量)进行了详细的分析和讨论。结果表明,以上因素对绿原酸萃取率都有一定的影响,在各单因素试验条件下选择乙醇作为夹带剂、乙醇浓度70%、乙醇用量400 mL/100 g、萃取温度50℃、萃取压力30 MPa、萃取时间5 h和CO2流量3.5 L/h为好。

2 绿原酸的分离纯化方法

2.1 萃取法

陈立钢等[15]通过流动注射的方法将动态微波辅助萃取与高效液相色谱相连接,用于测定金银花中的绿原酸,萃取过程在一个循环体系中完成。选择体积分数为60%的甲醇作为萃取剂,70 W的微波前向功率微波萃取5 min,并设定萃取剂流量为1 mL/min。在24 h内,连续分析6个样品,得到的日间精密度 (RSD)为3.4%。24 h分析2个样品,连续分析3 d得到的日间精密度 (RSD)为4.1%。在3个实际样品中分别加入一定量的绿原酸标准溶液,充分混匀,放置24 h后,用N2挥干溶剂,在上述选择的最佳条件下进行测定。每个加标样品分析2次,得到的平均加标回收率为98.1%,RSD为2.7%。

2.2 水提醇沉法

郑喜群等[16]研究了水提醇沉法从葵花籽中提取绿原酸的工艺,结果表明,水酶法提取葵花籽油脂后分离出的浸泡液进行真空浓缩到固形物含量为13%时,加入此时溶液量1倍的95%乙醇2次,沉降多糖,然后继续真空浓缩,冷却可析出纯度为75.9%以上的绿原酸。

2.3 大孔树脂吸附法

李丹等[17]利用NKA-9大孔吸附树脂对元宝枫绿原酸的吸附与洗脱性能进行了研究。结果表明:NKA-9树脂对元宝枫绿原酸具有较大的吸附容量,且易被解吸附,洗脱峰集中,分离效果较好。同时得到分离纯化的最佳条件为:进样液质量浓度0.26 mg/mL,pH为2.5,进样液体积为树脂柱床体积的4～5倍,体积流量1.5 mL/min。用体积分数30%、4倍床体积的乙醇对树脂进行洗脱,可得到纯度为26.62%的绿原酸粗品,收率达83.69%。

2.4 聚酰胺柱层析法

游庆红等[18]对金银花中绿原酸的提取和纯化方法进行研究。在纯化试验中选用乙酸乙酯萃取法和聚酰胺层析法,取3份采用最佳工艺条件提取的样品溶液5 mL,缓慢转移至装有3 g已处理过聚酰胺粉的层析柱中,分别用浓度10%、30%和50%乙醇溶液洗脱,以2 mL/min的流速使柱内液面高度保持在1～2 cm。每隔20 min采样1次并测定样品溶液中绿原酸的含量,从而绘制洗脱曲线。得出纯化的最佳方案,并对聚酰胺层析的层析条件和不同洗脱剂的洗脱效果进行考察。试验表明,乙酸乙酯萃取法纯化后绿原酸纯度为18.4%;吸附有绿原酸的聚酰胺以浓度30%的乙醇洗脱效果较好,得到的绿原酸纯度为33.2%。

2.5 膜分离法

杨祖金等[19]研究了超滤膜技术应用于杜仲叶绿原酸的分离纯化。以绿原酸转移率为指标,考察料液温度、超滤压力、超滤时间、膜截留分子量对绿原酸转移率的影响。正交实验结果表明,料液温度为40℃、超滤压力为0.36 MPa、超滤时间为60 min,膜截留分子量为200 000时,绿原酸转移率最高为67.57%,通过继续加入24 L的去离子水进行超滤,绿原酸的转移率可高达99.38%。

3 绿原酸的检测方法

目前,随着分析检测技术的快速发展,传统的检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被精确的检测方法所取代。比如,高效液相色谱法、气象色谱法等已经成为主流的检测方法。这些方法相对于传统方法,得到的试验数据更精确,试验结果更准确。

3.1 分光光度法

孙莲等[20]研究了利用紫外分光光度法测定桑叶中绿原酸的含量,并建立薄层-紫外分光光度法测定桑叶中绿原酸的方法。采用甲醇为溶剂提取桑叶中的绿原酸,薄层层析法分离绿原酸,采用 T U-1800SPC型紫外分光光度计于329 nm处测定绿原酸的含量。结果绿原酸的质量在50～250 μ g范围内与吸光度成良好的线性关系 (r=0.999 6),平均回收率为95.0%,RSD为1.2%。

3.2 薄层色谱扫描法

李春红等[21]采用薄层色谱法对川银花中绿原酸的含量进行了分析测定,以建立川银花的质量控制标准。试验结果显示,绿原酸在0.8～8 μ g范围内具有良好的线性关系 (r=0.999 8),平均回收率为98.75%,RSD为0.29%。

3.3 高效液相色谱法

李红梅等[22]利用高效液相色谱法对蒲公英提取物中绿原酸含量进行了测定。采用Agilent Zorbax SB C18柱 (416 mm×250 mm,5 μ m),流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液 (10∶90),流速110 mLmin-1,检测波长324 nm,柱温30℃。结果显示:绿原酸的线性范围为0.04～0.60 μ g(r=0.999 2),平均加样回收率(n=5)为96.48%。

李鑫等[23]利用高效液相色谱法测定甘薯叶中绿原酸含量,并建立了测定甘薯叶中绿原酸含量的高效液相色谱方法。采用色谱柱 Lichrospher5-C18柱 (150 mm×4.6 mm,5 μ m),以A(水∶乙腈∶冰醋酸=980∶20∶5)(V∶V∶V),B(乙腈∶冰醋酸=1 000∶5)(V∶V)为流动相,线性梯度洗脱,流速0.3 mL/min,检测波长324 nm。结果表明,绿原酸在5～100 μ g/mL时,绿原酸质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为y=195.47x+144.29(r=0.999 1),平均回收率可达93.1%。

3.4 气相色谱法

别立洁等[24]对烟草中的主要成分绿原酸进行了定量分析,并建立了测定烟草中绿原酸含量的气相色谱方法。采用HP-6890气相色谱仪,色谱柱:HP-5(Crosslinked 5%pH ME Siloxane),30 m×0.32 mm×0.25 μ m Film Thickness毛细管柱,流速:6 mL/min,温度:180℃ (保持 2 min)升温到250℃(5℃/min),载气:N2,检测器:FID。

3.5 毛细管电泳法

赵陆华等[25]采用未涂层毛细管柱,浓度为200 mmol硼酸与质量分数为10%甲醇为缓冲液,分离电压为30 kV,检测波长为328 nm,温度为25℃,进样条件为50 kPa,5.0 s。在此条件下测定鸟骨藤药材及其制剂中绿原酸的含量。结果表明,绿原酸质量浓度为21.0～105.0 μ g/mL的线性关系良好(r=0.999 7),平均回收率为99.16%,RSD为0.8%。

4 结语

综上所述,绿原酸的提取技术以物理因素辅助溶剂提取为主,而酶法提取则是近期开发的一种新兴提取技术;纯化技术以萃取技术和树脂分离技术相结合,近年来,超临界流体萃取法作为一种将提取和纯化同时进行的高效技术越来越多的被运用到绿原酸的分离纯化上;随着分析检测技术的快速发展,传统的绿原酸检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被高效液相色谱、气相色谱等精确的检测方法所取代。近年来,随着技术的快速发展与成熟,对于绿原酸各方面的研究也日趋完善,但是由于这类化合物存在多个酚羟基,所以对光、氧气、pH、温度、酶等因素都比较敏感,在提取、加工以及后续的检测中会生成人工产物,这样不仅会影响药效,也会影响食品或饮料的质量。所以,有必要对相应的研究方法及过程进行探讨。通过深入研究,必将找到简单易行、收率高、检测方便的方法,将有助于推动对于绿原酸的研究以及相关的产品开发。

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